无缝克隆——让载体构建更简单

让载体构建更easy，分子克隆其实可以ze么快！每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？今天就给大家详解一下可以一步法快速构建 同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较：拼接IMG P匚8i E UI十天半月实验没进展的片段PCR+线性化载休转优阳性率L1100%目的片fePCR瞪咼收i|矗协传统鬥克隆无缝克隆传统克隆无缝克隆 PCR引物设计需引入载体上的酶 只需要一次反应即可完成定向克切位点，PCR产物再经过酶切、胶隆，省略酶切、酶连等过程；回收、连接后定向克隆到目的载体 对酶切位点无要求，可以把目的片上；段插入到任意载体的任意位点； 需要查找合适的酶切位点，购买各 连接片段之间不会引入任何其他序种内切酶；列； 阳性率低； 可以同时克隆多个片段。 多个片段，通常只能分多次拼接。无缝克隆相较于传统克隆的方式，优势显而易见，主要体现以下几点：1、可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；2、可同时连接多个DNA片段，最多可达10个；3、不附加任何多余序列，精确定向连接；4、体系反应时间仅需20min ,快速反应。那无缝克隆到底应该怎么做呢？下面我们就来详细了解下无缝克隆其原理：在基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的。唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。PCRMS :岳徨址换粒（降汎匕J =2 5 : 1取ICWHB-infiJ5icinFCRI才勒嘶与栽悴 i習丰蠻同晦）图 1 ：无缝克隆原理图在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下3 点：1、线性化目的载体（图1左上）：用酶切或是PCR方式1 ） 质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶 纯化。2 ）质粒PCR法如果没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。插人应点图 2.PCR 法线性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段2、PCR获取目的片段。设计的引物5端需要和线性化载体末端有1525bp的重叠（图中蓝色和黄色片段）；兀何注G邑TTHGCTT品?卅世驰CTIGGCAGTCn狀TTCSAACITAA图 3：目的片段同源的引物设计针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR引物，其重叠区域为1525 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是PCR法线性化载体，扩增插入片段的PCR引物5端直接设计成与线性化载体末端1525 bp重叠即可。3、按照一定比例把二者混合在HB-infusion （无缝克隆试剂盒）的2x预混液内，509反 应 20min 后直接转化 E.coli 即可。反应体系如下：2-3片段4-6片段阳性对照PCR产物+銭性化载体质粒Xpl(G.02-0.5 pinols)X|ll(0.2-1 ptuoLs)10応HB-lufUsion MasterMil (2 k)Ittgl10|d101超纯h3oUp to 20 plCp to 20 pl通过以上三步，就可以完成质粒重组。只要再进行后续的转化感受态等操作，就可以完成载体构建。当然，这么简单高效的分子克隆方式，怎么能少了 HB-infusionT无缝克隆试剂盒呢！ 无论你是要做简单的克隆，还是多片段克隆或者突变体克隆，包括载体改造和crispr载体构 建等都可以用到无缝克隆试剂盒。实例分享一：小片段（ikb ）和大片段（4kb ）基因克隆比较:100Qbpftf4GOObpHB-inlusion外源DMA 區度传统DMA前切幕国产进口主流连接无縫克圍咖盒 聲克隆试列盒实例分享二：6 个片段克隆比较