大豆脂肪氧合酶的提取工艺

大豆脂肪氧合酶的提取工艺脂肪氧合酶对食品质量的影响有利与弊两个方面。脂肪氧合酶是食品原料 中有的一种酶，它的作用对食品质量的影响既有助于提高某些质量指标如颜 色、质构、 风味等，又可能对某些质量指标如营养成分含量、食品颜色等有不 利影响。脂肪氧合酶属氧化还原酶。脂肪氧合酶中含有非血红素铁，专一催化具有 顺， 顺 -1， 4- 戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，通过对其分子加氧，形成过氧化 氢衍生 物。脂肪氧合酶广泛存在于植物界中，特别是从人类大量食用的大豆中 提取的脂肪氧 合酶活性高于其它植物来源。大豆中蛋白含量为40%左右，脂肪氧合酶是大豆中活性最高的酶。许多研究结果认为脂肪氧合酶在植物生理，如植物萌发、生长、发育、衰 老、 抗性等物质转化中起某种重要调节作用，会影响植物脂肪在萌发期的氧 化，脂肪过氧 化形成乙烯影响植物叶片衰老，脂肪氧化影响种子的衰老、死 亡、果蔬催熟和脱落， 可以运用于植物抗病、抗虫和伤害反应中。一、试验目的 了解大豆脂肪氧合酶的提取工艺了解哪个工艺对脂肪氧合酶酶活影响最小 二、试验原理以低温脱脂大豆粉为原料，采用水浸提、二次盐析、聚乙二醇 （ PEG 共沉淀 等方法提取脂肪氧合酶，并对 LOX 活性进行测定和比较，以便综合评价提取方 法的 优劣。同时研究了影响脂肪氧合酶活性的因素和化学微环境影响，为保存 和合理利用 LOX 提供理论基础。三、试验材料原料：大豆；试剂： Tween 20（化学纯）；亚油酸；其它化学试剂或溶剂均为分析纯。设备：752型紫外光栅分光光度计，PHS-3B精密pH计，LD4-2型离心机,81-2 型恒温磁力搅拌器。四、试验方法1.脂肪氧合酶的提取大豆经粉碎后再经石油醚多次浸提得到脱脂大豆粉。每批次10 g脱脂大豆粉为原料 ,料液比为 1 ： 10(质量：体积 )，按下述 5 方法提取脂肪氧合酶：(A)水浸提法：加水搅拌50 min, 4 000 r/ min条件下离心20 min,上清液即 为 粗酶液。滤液中加入(B)酸提-盐析法：加水并用1 mol/ L盐酸调pH值至4. 5,搅拌50min,过 滤;体硫酸铵至40 %饱和，离心分离20 min，弃去残渣；上清液 中加入 体硫酸铵至60 %饱和，离心分离20 min，沉淀用pH值9. 0的0. 2 mol/ L的硼酸盐 缓冲液溶解得到酶液。(C缓冲液提-盐析法：加pH值4.5的乙酸-乙酸盐缓冲液，搅拌50 min，其余 步骤同 (B)。(D) 碱溶-酸提-盐析法:加水并用1mol/L氢氧化钠调pH值至9.0,搅拌 30min，离心20min，弃去沉淀；上清液用1mol/L盐酸调pH值至4.5,继续搅拌， 其余步骤同 (B)。(E) 聚乙二醇共沉淀法：加水并用1mol/L盐酸调pH值至4.5，搅拌50min，过 滤；滤液中加入50%的PEG-6000至PEG浓度达30%，继续搅拌40min，离心 分 离20min，用pH值9.0的0.2 mol/ L的硼酸盐缓冲液溶解沉淀，滤去不溶物 得到酶 液。2. 酶活测定25C、pH值9.0下，以亚油酸为底物的3 mL反应体系在234 nm处每分钟 增加 0.001吸光度值定义为一个酶活单位。将0. 25 mL Tween 20分散于10 mL pH值 9.0的0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入0.27 mL亚油酸，充 分混合， 加入 1 mol/ L 氢氧化钠溶液使体系澄清，调 pH 值至 9. 0 ,然后用上述缓 冲液稀释 到500 mL作为底物。取0. 2mL酶液(已稀释一定倍数)移入1.5mL的底 物溶液中， 混匀后于25C水浴中恒温3min,用5mL无水乙醇终止反应，然后加 入5mL蒸馏水，混匀后测定反应液在234nm处的吸光度。空白样为0. 2 mL酶 液中加5 mL无 水乙醇，再加1.5 mL底物溶液，于25c恒温3 min,然后加入5 mL蒸馏水。五、试验结果与分析结果记录：提取方法(A) 水浸提(B) 酸提-盐析物态总酶活酶比活/(Ug-1)或-1(UmL) (C 缓冲液提-盐析(D) 碱溶-酸提-盐析(E) PEG 共 沉淀分析：盐析法是比较古老的方案,但目前仍广泛采用,它根据酶和杂蛋白在高浓 度盐溶 液中的溶解度差别进行分离纯化。最常用的盐是硫酸铵。二次盐析法是 用较低盐浓度 除去杂蛋白,再用较高盐浓度进行分离纯化。盐析法的优点是简 便、安全、重现性好, 缺点是分辨率低、纯度提高不显著。共沉淀法利用离子 型表面活性剂如十二烷基硫酸 钠、非离子型聚合物如PEG 等，在一定条件下能与蛋白质直接或间接地形成络合物。使蛋白质沉淀析出；然后再用适当方法使 需要的 酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化目的。PEG无毒、溶解时散热低、形成沉淀的平衡时间短，一般当 PEG 的浓度达到 30%时，就可以 使大部分蛋白质沉淀出来