HPLC使用注意事项

色谱柱使用注意事项1. 色谱柱使用过程中切忌干柱子、进空气、反向使用 连接色谱柱时候，必须反复确认通路，即由进样阀连接色谱柱的进样口。 色谱柱使用过程中应该计算好当天所用流动相，配制足够的流动相，以防干柱。 使用后应该从高效液相仪器上拆除，并用柱塞堵严。2. 判断是否冲洗完成，基于以下几点(1) .在样品测试前，知道测试过色谱柱的一些性能；(2) .在样品测试过程中，样品的洁净纯度以及进样情况影响色谱柱的冲洗(3) .一般是以柱压来衡量(4) .无固定冲洗时间，具体可参考使用说明书，一般是10-20倍柱体积或是约30-60min冲 洗时间(5) .冲洗溶液的选择：一般是以“相似相容”为原则(6) 使用保护柱能够延长色谱柱的使用寿命色谱柱的使用和注意事项色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速 时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水, 反之亦然。 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在 柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前 面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅 胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而 且应该经常更换。 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残 留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷或氯仿） 依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略 最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射 100-2001四氢咲喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢咲喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除 去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸0.1%）梯度洗脱能除去 蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能 强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对 禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片 或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰 变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出12mm高度（注 意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色 谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（530mm）, 可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH29范 围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有 色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷, 使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平 衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、 溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使 用，应每隔45天开机冲洗15分钟。一、色谱柱的管理制定色谱柱管理的标准操作规程并严格执行。每一根新购进的色谱柱必须造册登记内 容包括:生产公司、品名、型号、规格、购进时间、启用时间、单价、柱内保护溶液等。色 谱柱分类存放，硅胶柱、化学键合硅胶柱、氰基或氨基柱、离子交换树脂柱、凝胶柱各用一 个色谱柱盒,盒上贴上标签，注明类别。随柱说明书装入密实袋附在登记本上。每启用一根色谱柱,在色谱柱上贴上标签，注明启用日期。每根柱子每两个月保养一次，特别是对于一些使用 频率少的柱子，因为放置时间长，容易干柱,每一次做好保养记录。对于确已失效的柱子,做好停 用记录，不能随意丢弃，专门存放，如果现用的柱子的填料需要填补，可以用存放的柱子的填料。 在从事生产的单位的质检部门,对于使用时间较长柱效降低的柱子，可把它用于检测产品的中 间体。二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变 化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件 是最佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样 品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。1样品前处理a、最好使用流动相溶解样品。b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用0.45pm的过滤膜过滤除去微粒杂质。2. 流动相的配置液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动 相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱 中）。b、流动相与样品不产生化学反应c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命可 运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸 收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测, 还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。3、流动相流速的选择因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特 定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般 选择1ml/ min,对于内径为4.0mm 柱，流速0.8ml / min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分 析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。a. 流动相要求使用0.45 pm滤膜过滤，除去微粒杂质。b. 使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高 柱性能。4. 流动相平衡：a、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。流动相一定要 使用色谱级别的溶剂。如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。b、流动相使用前需用微孔滤膜过滤消除流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。缓冲 液与其他流动相混合后应重新过滤避免溶解度变化造成产生新的沉淀。不应使用纯水作为流 动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5%的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。还可以使色谱柱更容易平衡)。C、流动相需脱气后使用，可避免因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。如果测试时使 用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区别，应该使用过度分布的形式进行平衡。避 免由于流动相的突然变化造成柱压增加过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统 的损坏。正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。5. 色谱柱的使用(1) 柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免 柱床产生空隙。(2) 如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析 配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。(3) 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉 下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时 应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。(4) 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水， 反之亦然。大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围(5 )如使用柱温控制装置时，应注意在通人流动相后才能升温。(6) 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱 头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。(7) 选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱, 分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和，避免 分析柱中的硅胶基质被溶解。(8) 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在 进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而 且应该经常更换。(9) 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流 动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常 规分析需要50-75mL。(10) 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁 止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。(11) 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或 将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进人柱内，使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变 形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。(12) 在完成分离分析工作之后,不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5h 以上，以除去色谱柱内的杂质。(13) 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水过渡即每天分析开始前必须先用纯 水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡;分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除 去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。三、色谱柱的保养和再生清洗色谱柱使用一段时间后，常遇到柱子被污染，柱效会有一定程度的下降，采用适当的方法 对色谱柱进行保护，可以延长色谱柱的使用寿命。保护柱(预柱)的使用:对于较昂贵的色谱柱，可以在柱前加一保护柱，防止样品中杂质污染分析 柱，对于制备柱，因其进样量大，使用保护柱尤为重要。再生处理包括正反两种顺序：硅胶柱（未键合）：正己烷一-二氯甲烷一-异丙醇硅胶基质非极性键合相（C18, C8, C4, C2, Cl, PHENYL, CN, NH2）： 95%水/ 5%乙腈（甲 醇）一-乙腈（甲醇）一- THF；（含蛋白污染物）B从10%到90%的梯度，A=0.1%TFA 水溶液，B=0.1%TFA乙腈溶液硅胶基质极性键合相（CN, NH2, DIOL等）：氯仿一-异丙醇一-二氯甲烷一-庚烷 离子交换树脂柱（SCX/SAX等）：一般采用高浓度（1-2molL）的NaCl溶液油脂等物质可用低浓度碱溶液（如0.1molL的NaOH溶液）冲洗酸性有机物用低pH缓冲液冲洗碱性有机物用高pH缓冲液冲洗，再用蒸馏水甲醇二氯甲烷冲洗。 凝胶色谱柱（GPC/GFC等）：通常用稀的氢氧化钠或非离子型去垢剂冲洗疏水蛋白可用24%或30%乙腈冲洗过夜除去亲水蛋白可用30%-50%乙酸除去痕量胃蛋白酶可用蛋白水解酶处理分解，再用蒸馏水一- 甲醇一-蒸馏水冲洗。建议清洗柱子的其他条件：溶剂体积：推荐使用柱体积的10-20倍流速：推荐使用常规流速的1/5-1/2不同流动相转换：推荐换相时浓度梯度由小到大色谱柱的正确使用色谱柱是一类昂贵的色谱耗材，正确的使用和维护对保证色谱柱的正常使用和延长寿命至关 重要。1、色谱柱使用前的注意事项（1）色谱柱内的存储液一般色谱柱的存储液，如没有特殊说明，均为质检报告中所述流动相。氨基（NH2）、氰基 （CN）、硅胶柱（Si02）均为正相条件一一正己烷/异丙醇体系，反相色谱柱均为甲醇/水体 系。检测前，请用相互溶的试剂将其替换。（2）新色谱柱的平衡 新反相色谱柱：用纯甲醇冲洗色谱柱30个柱体积，再更换成能与检测流动相互溶的流动相 冲洗 30 个柱体积，最后用流动相稳定系统至基线平稳。新正相色谱柱：用异丙醇0.5ml/min冲洗色谱柱30个柱体积，再更换成检测流动相，稳定 系统至基线平稳。2、色谱柱的使用方向 在高效液相色谱柱标签上，所标注的箭头方向为流动相流向，使用时也按此方向。避免双向 混用，导致两端填料同时污染，不利于色谱柱的再生和维护。3、流动相和样品保持洁净由于悬浮在样品或流动相中的细小颗粒会堵塞色谱柱两端的筛板，各种试剂尽量使用色谱纯 级的，用量少的试剂纯度至少是分析纯。水最好是超纯水和全玻璃器皿双蒸水。使用前建议 用0.45p m的滤膜过滤。样品溶液使用针筒过滤。样品中的杂质是造成色谱柱污染、柱效下降的最主要原因之一，最好使用相匹配的保护住。 样品溶剂与流动相要相匹配，不能出现样品不互溶，极性相差太大等现象，否则会造成色谱 峰形变差以及鬼峰等现象。使用流动相溶解样品能有效的避免上述情况发生。4、色谱柱允许使用的 pH 范围每款色谱柱都有自己特定允许使用的pH范围，请参考你的色谱柱的使用pH范围。3.色谱柱的维护1、使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)。2、流动相使用前必须经脱气和过滤处理。3、避免流动相组成及极性的剧烈变化。4、大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围。5、如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存乙腈 中。6、压力升高是需要更换预柱或冲洗色谱柱的信号。系统注意事项1、开、关系统，流速应有缓冲(1ml/min0.8ml/min0.4ml/minOml/min),以免压力突变致使柱头填料塌陷。2、流动相是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC 流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、 活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水），冲洗510 个柱体积以后才更换强溶剂。3、做完测试后切忌直接用 100%有机溶剂冲洗柱子，须用 90%水-10%有机溶剂（如流动相 是缓冲液，应用纯水或含5%有机溶剂-水溶液）冲洗至少30min后，用有机溶剂冲洗30min 左右，最后将色谱柱保存在有机溶剂中。4、更换色谱柱前，须对使用的色谱柱进行冲洗、平衡后，保存在有机溶剂中（最好是乙腈 中）。5、取下色谱柱时，应立即将两端封口。6、除特殊情况外，一般都应使用预保护柱。平衡色谱柱的原因反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的，由于色谱柱在储存或运输过程中 可能会干掉，如不进行平衡，样品中含有的一些盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质 和其它一些生物物质很容易与HPLC柱发生相互作用的物质，使这些物质吸附在色谱柱上， 使色谱柱污染。如何平衡色谱柱？因此在用流动相分析样品之前，我们应先使用1020倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱 柱；如果我们所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡”。平衡过程中，将流速缓 慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需 要较长的时间来平衡）。色谱柱污染后可能出现的情况？滞留在色谱柱中被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相， 有时候这些分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理，这些非目标产物的干扰能被检测 器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线扰动及基线漂移等现象，在色谱图上出现“怪峰”， 表现为负峰、宽峰、馒头峰、双头峰及前吐舌后拖尾峰和 保留时间会波动。这些行为通常 只有通过平行实验才能发现。色谱柱污染后如何清洗和再生？当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的柱子能产生反 压问题。 被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如 果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往 能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90100%的溶剂B （双溶剂反 相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。例如，柱子中残留的脂质就能用非 水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常 最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物质如脂质和油 类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时，必须 借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如，异丙醇是一个非常好的作为中 间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非 常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。冲洗色谱柱时，冲洗液由色谱柱出液端直接接 入废液瓶，不能流经检测池，以免检测池被污染。反相色谱柱没有使用缓冲溶液，请使用以下溶剂系列再生：100%甲醇100%乙腈75%乙腈-25%异丙醇100%异丙醇100%二氯甲烷 100%正己烷100%二氯甲烷100%异丙醇100%乙腈。反相色谱柱使用缓冲溶液，请使用以下溶剂系列再生：水乙腈氯仿（或异丙醇）乙腈水。表 用来冲洗的溶剂体积、时间色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积 冲洗时间150-4.6 2.5ml 50ml 50min250-4.6 4.2ml 80ml 80min每种溶剂至少冲洗20个柱体积。如250mmx4.6mmHPLC分析柱，可以用1ml/min的 流速来冲洗，冲洗后使用没有缓冲的流动相进行平衡色谱柱。注：如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，说明色谱柱 严重污染，冲洗溶剂可以用0.05M稀硫酸，二甲基亚砜（DMSO），二甲基甲酰铵- 水（50： 50），用低于0.5ml/min的流速冲洗非常有效。液相色谱柱是昂贵的色谱耗材，是液相色谱仪的心脏，有着严格的生产标准和测试程序，为 了充分发挥色谱柱的性能，最大程度延长色谱柱的使用寿命，请仔细阅读此部分。色谱柱的身份确认：为了保证每一支色谱柱的质量，Ultimate的每一支色谱柱都有唯一的身份编码，根据此 编码，我公司可以将质量问题确定到个人，为了保障你的利益，收到色谱柱时，请完成以下 程序：1、仔细查看包装盒是否完好，与自己请购的色谱柱是否一致；2、盒内是否有质量检验报告及检验人员签名；3、色谱柱表面有无碰撞伤痕，柱两端保护色谱柱的塑料堵头是否完整；4、色谱柱柱体是否贴有色谱柱的身份标牌，并仔细对照包装盒与色谱柱标签上的型号和 编号是否一致。结构和安装：结构：Ultimate的高效液相色谱柱柱管材质均为316L不锈钢，两端结构完全一致，其结构如图一：图一 Ultimate 系列液相色谱柱结构安装：为了保证色谱柱使用时有最高柱效，连接管路尽量使用适合的细径管路，色谱柱进出口 的连接必须非常适配，连接管端口部分必须平整，不能有毛刺和切口斜面等现象，各种连接 管路请使用专业工具切割修整；1、取出色谱柱，仔细查看柱身洗脱液流向箭头标识，用手旋下柱两端的塑料堵头，放好 色谱柱，使洗脱液流向和柱身所示流向一致，如图二所示：图二 色谱柱的正确连接2、用手将 连接管路的不锈钢或者其它材质的接头 旋入色谱柱两端，管路接头要和色谱 柱接口连接紧密，确保零死体积连接，在色谱仪正常运行时没有漏液。色谱柱的正确使用：色谱柱是昂贵的色谱耗材，正确的使用和维护对保证色谱柱的正常使用和延长寿命至关重 要。1 、色谱柱使用前注意事项：1）色谱柱内的存储液：Ultimate色谱柱的存储液，如没有特殊说明均为质检报告中所述流动相，氨基NH2）、 氰基（CN）、硅胶柱（SiO2）均为正相条件-正己烷/异丙醇体系，反相柱（C1、C4、C8、 C18、苯基Phenyl）均为甲醇/水体系，检测前，请用相互溶的试剂将其替换；2）新色谱柱的平衡：新反相色谱柱：用纯甲醇冲洗色谱柱30个柱体积，再更换成能与检测流动相互溶的流动 相冲洗30 个柱体积，最后用流动相稳定系统至基线平稳；新的正相色谱柱：用异丙醇0.5ml/min冲洗30个柱体积，再更换成检测流动相稳定系统 至基线平稳；2、色谱柱的使用方向：Ultimate高效液相色谱柱标签上的箭头方向为流动相流向，使用过程时也按此方向，避 免双向混用，导致两端填料同时污染，不利于色谱柱的再生和维护；3、流动相和样品保持洁净： 由于悬浮在样品或流动相中的细小颗粒会堵塞色谱柱两端的筛板，各种试剂尽量使用色谱纯 级的，用量少的试剂纯度至少是分析纯，水最好是超纯水和全玻璃器皿双蒸水，使用前建议 用0.45ym的滤膜过滤；样品溶液使用针筒过滤；样品中的杂质是造成色谱柱污染、柱效下降的最主要原因之一，复杂样品可选样品预处 理柱（SPE柱）进行样品处理，如果不方便处理，最好使用相匹配的保护柱，样品溶剂与流 动相要相匹配，不能出现样品不互溶，极性相差太大等想象，否则会造成色谱峰形变差，鬼 峰等现象，使用流动相溶解样品能有效的避免上述情况发生；4、色谱柱允许使用的pH范围：每款色谱柱都有自己特定允许使用的pH范围，请仔细对照你的色谱柱的使用pH范围 （表一），在pH范围以外使用，会使硅胶基质溶解或键合相水解，对色谱柱造成不可恢复 的损伤，如果在临界pH处使用，分析结束后立即用适合于色谱柱保存并与当前使用的流动 相互溶的淋洗液置换掉。表一 Ultimate系列色谱柱pH耐受范围柱型号Cl、C4、C8、C18PhenylCNAQ系列LP系列pH范围1.5-10.01.5-10.01.5-9.01.5-10.01.0-9.0色谱柱的保存短时间保存：间隔不超过四天，色谱柱按平时维护程序冲洗至基线平稳，反相色谱柱保存在不带有缓冲 盐、离子对试剂的有机相/水溶液中，有机相不低于20%；正相色谱柱正相使用保存在纯正 己烷中，反相使用保存在纯有机溶剂中；并将随柱的塑料堵头旋紧密封。长期保存：反相色谱柱保存在80%甲醇或 80%乙腈水溶液中；正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷 中，反相使用时需将柱内存储液用异丙醇置换，最后用正己烷保存；最好将色谱柱从仪器上 取下，并将随柱的塑料堵头旋紧密封。色谱柱的维护：1、柱压升高是每个色谱工作者都很头疼的问题，长时间使用造成柱压的缓慢升高通常是 正常现象；短时间甚至是突然的柱压升高通常是异常升高，排除仪器的故障，确定是色谱柱 自身原因，一般有以下几点：1）柱头的过滤筛板污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）： 解决方法：a、在柱前端加上在线过滤器或保护柱，用甲醇/水=20/80 l.Oml/min反向冲洗色谱柱180min；b、在柱前端加上在线过滤器或保护柱，反向使用；c、可将柱头打开，将色谱柱头中过滤筛板取出，在稀硝酸溶液内超声清洗20min，纯水超 声清洗20min,最后用甲醇超声清洗20min,重新装入色谱柱；2）柱头填料污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）：解决方法：a、用可以溶解污染物的溶剂较长时间（180min）反向冲洗色谱柱；b、可将柱头打开，小心取出被污染的填料，用相同的填料重新装入修复；3）pH 使用不当造成的损伤：解决方法：pH使用不当造成固定相的缺失或塌陷，很难使色谱柱恢复，只能更换色谱柱。2、使用保护柱和在线过滤器：样品和流动相中不能完全过滤掉及泵磨损、密封圈和管路老化产生的固体颗粒物，进入 到色谱柱中就会堵塞筛板，导致柱压升高，柱效下降，保护柱和在线过滤器上都有筛板，孔 径与分析柱的孔径相同，能阻止颗粒物到达色谱柱，在分析故障中，柱压升高占很大比例， 因此建议您在色谱柱前端加上在线过滤器或者保护柱；3、缓冲盐的正确使用：缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，其使用不当会析出，加快泵柱塞杆和密封圈，流 通阀的磨损，堵塞色谱柱头筛板，填料基质上的微孔和颗粒间的间隙，使填料板结柱压升高， 阻碍基质上键合相的碳链自由舒展，使色谱柱保留能力下降，柱效降低，缩短其使用寿命， 缓冲盐析出后很难去除，因此正确的使用缓冲盐对延长色谱柱的使用寿命非常重要，具体方 法如下：“使用前过渡! 使用后冲洗!”1）等度条件：分析前后用过渡流动相冲洗柱体积不少于20-30 个柱体积，或分析完成后用过渡流动相以0.2ml/min （根据柱规格调整）冲洗过夜；2）梯度条件：分析前，用与初始流动相组成相同的流动相以分析流速冲洗色谱柱不少于 20-30个柱体积，分析后，用该过渡流动相冲洗色谱柱不少于20-30个柱体积，且梯度尽量 平缓，避免缓冲盐析出。过渡流动相：有机相和水相的比例和分析流动相中两相比例一致，或者水相比例高于分析流 动相，绝对不含缓冲盐。3）缓冲盐析出：具体补救方法见 色谱柱常见问题和解决方法-3、缓冲盐结晶析出解决方 法。4、避免强保留物质在色谱柱保留： 强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，是一个缓慢的过程，一段时间后会对样品成 分产生额外的保留行为，引起峰变宽，拖尾，使柱效下降，保留时间变化，到一定程度时会 导致柱压升高，对许多样品特别是复杂样品很难判断其是否含有强保留物质，因此要预防这 一切的方式，坚持每天分析完成后用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上。 清洗方法：1）未使用缓冲盐，每天分析完成后用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上；2）使用缓冲盐，用上述方法去除缓冲盐后，用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱 体积以上；3）补救方法：水 乙腈 异丙醇（或氯仿） 乙腈 水，每一步需要冲洗不少 于 30 个柱体积。注意：不要轻易打开柱头，因为柱头一旦打开，很难恢复到新柱的水平，因为柱头打开而造 成的检测后果，客户自行负责。色谱柱再生： 色谱柱作为液相色谱中的核心检测部件，会随着使用时间和进样次数的增加，出现异 常的色谱现象，如果一根色谱柱的柱效太低或者柱压太高，通常认为该色谱柱使用寿命已到， 为了延长色谱柱的使用寿命，除了完全按照每一款色谱柱的性能使用以外，适当的色谱柱再 生是很有效的途径：1、氰基（CN）色谱柱的维护和再生：CN基柱属于中等极性的固定相，作反相色谱时操作和维护和C18柱完全相同，增加水 相比例，可以促进样品的洗脱，但是CN属于短链的键合相，水相比例太高易使CN键水解， 尤其在色谱柱 pH 耐受范围以外，极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条 件下使用，需要按以下程序用15个柱体积溶液冲洗，如下：95%水/5%乙腈一THF四氢 咲喃一95%乙腈/5%水并保持95%乙腈/5%水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。 在 pH 耐受范围条件使用时，也比较伤柱子，要注意冲洗，可以参照上述方法，时间可适当 减少。柱子使用一定时间后，柱效下降，需要老化再生，再生时用15个柱体积的下列溶液 冲洗：95%水/5%乙腈一THF四氢咲喃一95%乙腈/5%水再走流动相即可；CN 柱用于正相时，当柱子使用一定时间后，柱效下降，可清洗一下恢复柱性能，再生 时用10个柱体积的下列溶液冲洗：氯仿 异丙醇 二氯甲烷再走流动相即可；CN柱最理想的pH范围在pH 2.0-5.0；CN柱的保存，可用异丙醇或正己烷保存（保存溶剂中不能含水），两端封好，流动相改变 时要注意过渡和两相之间的互溶。2、反相柱的再生：反相色谱柱是使用最普遍的色谱柱之一，除按照以上内容使用以外，必要的再生清洗可以 有效的延长色谱柱的使用寿命，用下列每种溶剂2030 个柱体积冲洗：100%甲醇-100%乙腈-75%乙腈/25%异丙醇-100%异丙醇-100%二氯甲烷-100% 正己烷-100%异丙醇-100%甲醇3、正相色谱柱的再生：正相氨基柱的键合官能团氨丙基要比C18,C8柱的键合官能团易水解，所以其使用寿命稍 短，特别是使用反相条件时，要严格控制PH值范围，PH值越低流动相中水的比例越高越 易发生水解。注意：所有试剂都要严格脱水 用氨基柱检测酸性物质可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，一定程度上改变对某 类的分析物保留性质或表现为柱效下降，再生建议是：用5-10个的柱体积的含0.5-1.0%NH3的50-50乙腈-水溶液冲洗（冲洗后用不含碱的流 动相洗去多余的氨），分析酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1%。填料被样品中杂质累积污染，色谱柱表现行为柱压增高柱效降低等， 依次用：甲醇-异丙醇-氯仿-正己烷-氯仿-异丙醇-甲醇冲柱子（各以0.5ml/min的流速，20个柱体积），再换流动相NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和 碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用需要清洗一下，需要用10个柱体积 溶液冲洗，也是正相条件下使用色谱柱的再生，如下：95%水/5%乙腈-THF四氢咲喃-95%乙腈/5%水 并保持95%乙腈/5%水继续冲洗， 以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。反相使用氨基色谱柱的再生（每种淋洗液不少于30个柱体积）： NaOH （pH 9.0）-色谱纯水冲-平衡到流动相或者适合保存的溶液 其它正相柱（硅胶柱，Diol柱）的再生（每种淋洗液不少于20个柱体积）： 正己烷-异丙醇正相柱除水：含2.5 %二甲氧基丙烷（dimethoxypropane）和2.5 %冰醋酸的正己烷冲 洗 30 个柱体积。4.5.6. 一般来说，色谱柱评价包括五点：1柱效。这是我们普遍关注的问题，但waters仪器需买配套计算软件，而安捷伦仪器 不用。2 最大不对称因子。因为根据塔板理论色谱流出曲线形状是一类似高斯曲线，但实际上 是前陡后缓的曲线；一般在0.951.05之间。3 渗透性。这主要针对键合固定相柱，端基封尾技术。残余硅羟基多，对碱性物质的分 离有影响，对酸性物质可能分离不开。4 保留值。合适的保留值也是我们关注的因素。5 柱压降。柱压降越小，柱寿命可能越长样麒1. H*tcpCFfen2. frthl pariben3. Hvdr&corliEkOiu4. f-snopnsf&n5 propyl parbn fi. PrprArtolal7. Ibupro-Tn: ZOflBAX Eclipse XDB-C8 4用 x 76 nffli, 3-S pm 迫岸谓I： 44% 25 fflMti?-,pH 7.&0 : &6% 即即 壺斑；1.0 mkimln m： 25J C 检熬：UV 2M urn吋珀圍的却份前疔品呵淀吉赴pH变化凝生显训吏优 一展至很屮的0.05-0.25个pH变化弟仏7.8.9. 色谱柱的管理，有一个规范的流程很重要，有了流程之后，保证实验人员按照流程来操 作，是保证柱子有较长寿命的根本，如果有专人对色谱柱进行管理，并且不定期维护的 话，这活可能就会干的比较漂亮，否则，呵呵。柱子怎么才能用的久？我感觉这玩意是“三分使用，七分保养”一方面是使用的时候要注意，比如流动相PH值、流速、必要的样品纯化。 这些事情，更多的是对实验人员提出的要求，有一个基本的实验素质很重要，否则，酸 碱度很高的流动相直接进系统了，样品连基本的纯化都没有，进液相之前都不知道用 微孔滤膜过滤甚至连滤膜的极性都分不清楚就对上来过滤，这么用下去，什么柱子也扛 不住几天不是？最主要的还是日常保养 每次用完之后，必须要确认柱子已经被冲干净了才可以保存，梯度冲是个保持柱效很好 的方式，至于怎么冲就不多说了，但是那种用完了随便用个溶剂冲上一半个小时，在色 谱图上显示基线平了就停的做法，我个人认为是不可能冲干净的 柱子用的久了，柱效自然会下降，对每根柱子建立必要的档案，定期对柱效进行检测， 当柱效下降到一定程度的时候，及时对色谱柱进行再生，否则，柱效下降了还一直用， 最终的结果就是当发现柱子不行了的时候，直接挂掉，这个事情，可能有个负责任的管 理人员来做，效果会更好些10. 最近发现很多在用药典的方法的时候出现色谱条件无法重现的问题，针对这样的问题， 个人觉得主要还是问题在色谱柱上面，我就简单说说这个色谱柱：1目前色谱柱或叫分析柱其品种真是太多了，就说普通的C18色谱柱吧，也是有很多种， 具体的品种就不说了，而实质上如同我们做仿制药，由于其工艺不同，或是技术不同， 所含的杂质不同,或是说碳含量，封尾技术等的不同，对于相同流动相下其对药物的色谱 行为差别还是很大的，有的甚至是不出峰2.装填技术：简单说来对于一些常规的物质，一般的装填技术都是能够得到对物质的分 离，但是对于某些特殊的物质及杂质，不同层次的装填技术所产生的效果是有差异的， 可以说会出现这个厂家能分离这个杂质，而所谓的名厂的色谱柱反而不能得到很好的分离3. 碳含量：碳含量的多少、种类、纯度、大小等都是影响到其色谱行为，特别是保留时 间问题4. 柱效：由于受多种因素的影响，应该说柱效更是差别各异，有的会出现柱效很高，但 是却杂质分不开，如果某药物具有特异性，柱效一下降，基本是杂质与主峰完全重叠了5. 键合物：目前色谱厂家都有自己的一个研究小团队，可以根据客户的要求，定制一些 专门的色谱柱来分析一些特殊的药物，而普通的常规的色谱柱是不能达到要求，这也是 药典上很多不能重现的一个因素，可能出于保护吧，未写入药典，虽然规定了是某某柱 子，其实还是有讲究在里面，如果不能够仔细分析研究对比以及使用一些途径的话，问 题能够解决，但是需要花大量的时间、金钱等，所以不可闷头做实验，也要适当转变思 路6. 厂家：个人认为不要迷信所谓的大厂名厂，色谱柱的东西，不是越贵越好，应该说适 合的最好。至于如何适合，应该多多与色谱柱厂家沟通，你有些不知道的因素也是你卡 的地方，在色谱柱厂家的一句中或许就能得到答案，现在资源很丰富，要充分利用网络 资源，人力资源等7. 粒径：也是应该考虑的一个因素，他会影响其保留时间，以及出峰顺序等8. 长短：目前药典上用到超短柱的现象，比如33mm等，如果我们其他条件不变，而使 用其他普通长度的色谱柱，基本上问题很多，不是分不开，就是出现鬼峰等，其实就是 制标厂家设的卡，是一般的厂家不可轻易重现，当然也是有其自身的优点就是短、频、 快，有利于产品后期的质量检验工作，这应该说也是一个趋势吧，作为研发部门，我们 不应该仅仅是为了能够得到很好的色谱行为图，应该要引入后期的检验工作提供便利的 概念。因为如果使用250mm的色谱，有关物质运行40min左右，对于检验工作来说还 是不小的时间量。说一个ELSD利用的例子：某产品，有三个主要杂质，均为外标法， 而使用 ELSD 的战友都知道，一般采用三点随行标曲，加上含量测定对照标样，光进对 照品所需要的时间就是不小啊，大家可以去计算，再加上3+2，有关物质1+1，后面还 要补针等因素，还有如果还要做系统适应性试验，加起来，呵呵10. pH:不同的pH还是差别很大的，对于那些特殊要求的，一定要使用宽范围的，否则， 柱子的寿命，1周，1月，3月，很难说啊，所以一定要看清楚，搞明白，pH是否影响 其色谱行为11. 纯水柱：目前药典已经有使用纯水柱的，也就是没有使用有机相或是用很少。如果 我们用不耐纯水的色谱柱，柱子的寿命基本上很短，少则1月，多则3-4月就报废，出 现的主要问题就是发现保留时间怎么越来越短了？当然本人经验少，不可预知的情况很 多，反正就是不耐用，所以当我们发现怎么使用纯水的流动相（当然里面可能加盐类物 质），不要惊奇，赶紧去采购相应的分析柱吧，别去使用手头常规的色谱柱，钱多的另 算12. 耐压：也许会发现药典上使用非一般的流速，比如1.5,2， 3等，而发现我们的液相 怎么就不耐压，流速一上去就不行了，蹦掉了，漏液了，色谱峰变形了。不要奇怪， 除了使用非一般的液相外，还有就是柱子的问题，压力大了，色谱行为大大变化13. 其他因素：1）保养：一根新购的良好的色谱柱，其各个性能是最好的，随着使用的时间，频率等 寿命都是会下降的，如同人的寿命一样，不会长命万岁，只会有长命百岁，这里面就是 会不会使用，会不保养的问题了，平时注意养生的话，身体健康，长命百岁，但是如果 抽烟喝酒熬夜jjww的话，很难说，应该说色谱柱是3分用7分养。首先就是看厂家的 说明书，一般正规的厂家都是有保养说明的，不要不看，如果是英文等，也要看看，很重要2）再生：说明书也有说明，切忌盲目再生！3）4）今天说的够多了，个人观点，也是本人看帖的一点分析与研究，非权威观点，当然也包括一些实战经验在里面，没有试验的支持，是不会有好的观点与讨论的，仅供大家参考11. 色谱柱冲洗问：0.1M缓冲盐溶液-乙腈（80:20）作为流动相，实验完毕后用90%的水冲洗色谱柱，该冲多长时间呢?或该冲多少倍的柱体积？或是看基线是否平稳了？ 答：一般是10倍柱体积。看压力，如压力稳定，且与进样前（同样流动相）一致时，认为 是干净了