Western Blot 实验实用技术手册

Western Blot 实验技术手册Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相 载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶 蛋白在待检测样本中的表达情况。目前Western Blot已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术 之一.一、Western Blot基本操作流程图细胞/组织蛋白提取V蛋白定量、蛋白变性上样、电泳V一转膜V封闭V孵育一抗V洗膜孵育二抗V洗膜曝光或显色二. Western Blot 操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合 适的蛋白制备方法是至关重要的。 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样 品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂， 然后吸净PBS,加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地 转移至预冷的微量离心管中，4C离心12,000 rpm, 20 min （根椐细胞种类不同调整离心力）， 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将 组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期 可保存于-80C，每约5 mg加入约300 “预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4C摇 动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理 想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml）., 4C离心12,000 rpm, 20 min，轻轻吸取上清，转移至新预 冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其 他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法， Bradford 法、 和 Lorry 法或 BCA 法，一般推荐用 BCA 法 .BCA 测定方法如下:A 酶标板操作1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号12345678蛋白标准溶液（yL）01248121620去离子水（yL）2019181612840对应蛋白含量（yg）00.51.02.04.06.08.010.02、根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；3、各孔加入200yL BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec, 37C放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋 白含量（yg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5、稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20yL，加入BCA工作液200yL，充 分混匀，37C放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录 吸光值；6、根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（yg），除以样品稀释 液总体积（20yL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：yg/ul）。三、样品处理一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结 合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离 子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading buffer），并于95-100C煮沸5分钟，对于 多次跨膜蛋白，可以于70C加热5-10分钟，标准的上样buffer称为2X Laemmli buffer, 上样时与样本混合后变性上样即可，为了减少样品的稀释比例，也可制备4X或6X的上样 缓冲液，如果上样buffer称为2X Laemmli buffer，上样时与样本1： 1混合后变性上样即可. SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带 负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。四、PAGE电泳分离蛋白和转膜、封闭1）、 电泳聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚 合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）.，聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含 量（%T）和交联度（%C），T%=（a+b）/m*100%;和 C%=a/（a+b）*100%,其中：a=双体（bis） 的重量；b=单体（arc）的重量；m=溶液的体积（ml）。丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C 构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）.的总量百分浓度（w/v）。不同分子量的蛋白 选择不同的凝胶浓度（参考下表，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓 度胶分离。蛋白分子量（kDa）凝胶浓度（）4-402012-451510-7012.515-100101-1、阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过 程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书 选择购买或自提该对照样本1-2、蛋白分子量 Marker1-3、内参对照管家基因编码的 及体系是否正常工作，蛋白质分子量Marker的使用，是坚持电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证，内參名称莎子里大小适用范围bet a-act in43kDa胞.浆和全细胞GAPDH30-40kDa胞:浆和全细胞Tubul in55kDa胞:浆和全细胞TOAlZPorin31kDa线粒体COKIV16kDa线粒体Lamin Bl16kDa细胞檢汗适于去除核膜的样本）TEP38kDa细胞裱怀适于去除恥的样本）lOOKda 巧K曲一SOkdfl37Kaa 2OKSA巧畑一很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个 WB 实验过程 并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。内参 Beta-actin 抗体 at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per lane Lane 1 : HeLa nuclear Lane 2 : HeLa whole cell lysate Lane 3 : A431 cell lysate Lane 4 : Jurkat cell lysate Lane 5 : HEK293 cell lysate.2) 、上样于电泳每孔上样量为20-40聘蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔，电泳时间按 电流仪说明书推荐方法使用,(1 小时或过夜，取决于电压大小)，当染料到达胶的底部，关 电源停止电泳，胶不能存放，应立刻进行下一步的转膜。3) 、转膜杂交膜是WB进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个WB的使用是非常的重 要和关键的。可根据不同的检测目的和待测蛋白的特性选择合适的膜，常用的转移膜 有:PVDF膜、NC膜，现在使用频率最高的是PVDF膜。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤， 通常如果使用标准湿式转膜装置，可以设定 转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜，具体的转 膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋 白的分子量越小，需要的转膜时间越短， 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常 会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。湿式转膜三明治排列为：海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能 留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方(膜)电迁 移。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难 全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转 膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以 观察蛋白的残留情况。4) 、封闭杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点于看给结合引起非特异的 染色和背景，一般使用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上未结合位点来降低抗体的非特异 性结合，封闭剂应该封闭所以未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也 不与抗体或检测试剂有交叉反应。常用的封闭试剂有1-5%的BSA或者脱脂奶粉，缓冲液一 般选择TBST或者PBST。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可 以4C封闭过夜。五、一抗孵育参考一抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗，立即加入稀释好的一抗，室温在 侧摆摇床上缓慢摇动孵育1-2小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4C缓慢摇动孵育 过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。孵育完毕后，吸尽洗涤液后，再加入洗涤液(TBST/PBST)洗涤5-10分钟，共洗涤3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。六、二抗孵育参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。二 抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗， 一抗抗孵育完毕后吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一 小时。 吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以 适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。七、底物孵育和检测 显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法，而现在最常用的是化学发光法： HRP 化学发光底物Luminol （ECL法chemiluminescence）及其改良法，对于HRP偶联的二抗, 一般传统上使用ECL和ECL+，推荐使用后者，更灵敏。八、常见问题及分析问题可能原因验证或解决办法背景高封闭不充分延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA,血清等）一抗浓度过高增加一抗稀释倍数，抗体孵育温度过高4 C孵育二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应设置二抗对照（不加一抗），降低二抗浓度一抗或二抗与封闭剂 有父叉反应在孵育和洗涤液中加入Tween-20 以减少交叉反应.洗膜不充分增加洗涤次数膜不合适NC膜比PVDF膜背景低膜干燥保证充分的反应液，避免出现干膜现象没有阳性条带 或很弱一抗、二抗等不匹配订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/ 和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置 内参可以验证二级检测系统的有效性。一抗或/和二抗浓度低增加抗体浓度，延长孵育时间封闭剂与一抗或二抗有父叉反 应封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20，或更换封闭 剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶一抗不识别目的物种的靶蛋白检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对照样本中无靶蛋白或靶蛋白含量 过低（抗原无效）设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可 能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加 标本上样量至少每孔20-30ug蛋白，样本制备时使用蛋 白酶抑制剂，或分级提取目的蛋白。转膜不充分，或洗膜过度使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透，需正确的 转膜操作，勿过度洗膜过度封闭使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液，或更换封 闭剂,减少封闭时间一抗失效使用有效期内抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作 液现配现用二抗受叠氮钠抑制所用溶液和容器中避免含有叠氮钠（HRP的抑制剂）酶和底物失效直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活 了。选择在有效期内、有活性的酶联物，使用新鲜的底物.曝光时间过短延长曝光时间多非特异性条带 或条带位置不对细胞传代次数过多，使其蛋白表 达模式的分化使用原始或传代少的细胞株，或平行实验体内表达的蛋白样本具有多种 修饰形式：乙酰化、磷酸化、甲 基化、烷基化、糖基化等查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小蛋白样本降解使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂新蛋白或同族蛋白的分享同种 表位的不同剪接方式查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报导的 细胞株或组织一抗浓度过高降低抗体浓度，可以减少非特异性条带二抗浓度过高 产生非特异性结合降低抗体浓度，增加二抗对照 选择特异性更强，只针对重链的二抗抗体未纯化使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带蛋白存在二聚体或多聚体SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min, 以增强蛋白质解聚变性背景有白色/黑色 斑点转膜时有气泡或抗体分布不均尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动抗体与封闭剂结合过滤封闭剂暗片现白条带一抗或二抗加入过多稀释抗体的浓度目的条带过低/过高SDS-PAGE胶浓度选择不合适调整胶浓度，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的 蛋白用咼浓度胶“微笑”条带迁移过快 电泳温度过高降低电泳速度，低温电泳（冷室）转膜不充分膜没有完全均匀湿透使用100% methanol浸透膜靶蛋白分子量小于10,000选择小孔径的膜，缩短转移时间靶蛋白等电点等于或接近转移 缓冲液pH值可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5）或使 用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液甲醇浓度过高过咼甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在 凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量 蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替转移时间不够Thick gel对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间