细胞悬浮培养

细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养(cellsuspensionculture)是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术1。应用学科：细胞生物学(一级学科)；细胞培养与细胞工程(二级学科)定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。应用学科：生物化学与分子生物学(一级学科)；方法与技术(二级学科)2单细胞制备的方法2.1机械法早期用机械法分离叶组织单细胞oBall和joshi(1965)、joshi和noggleC1967),以及joshi和Ball(1968)曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini(1972)指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功2。2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞3。2.3 愈伤组织诱导法以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。由于一般愈伤组织的细胞并不是均匀一致的，直接由外植体诱导的愈伤组织，若不经过继代则很难获得均匀一致的疏松性。只有在继代培养中不断选择那些疏松性好、细胞状态好的细胞不断继代培养，才能获得大量均匀一致、疏松易碎、适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织。由愈伤组织建立悬浮培养细胞系是目前细胞培养中广泛采用的一种方法。3. 悬浮培养的条件一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件：一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；三是生长迅速。要建立良好悬浮细胞系需注意以下事项：不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度，结构也可松可紧，利用这些特征可使愈伤组织分散成为单细胞或很小的细胞团。诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。一般用颗粒细小、疏松易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织，比较疏松易碎，经过几次筛选、继代稳定后，可以用于诱导悬浮细胞系。用于培养愈伤组织的培养基，可以继续用于悬浮培养，这种培养基就称为条件培养基(conditionedmedium),但遇到悬浮细胞变褐、生长很慢或停止等，就要用心得培养基。悬浮细胞进行继代与选择的方法有：将培养物摇匀，静置片刻，用吸管吸取培养基中部的培养物(此处细胞团小而均一，胞质浓厚)，也可通过过滤收集到小细胞团进行继代培养4。4. 细胞初始培养细胞初始悬浮培养的做法是，把适宜的愈伤组织转移到三角瓶或其他适当容器里的液体培养基中，将容器置于摇床上振荡培养。振荡培养作用是：Q可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们分散成小细胞团和单细胞；Q振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布；Q液体培养基的运动促进培养基和容器内空气之间的气体交换，避免细胞缺氧而抑制生长。根据培养基在容器中的运动方式来区分，有4中振荡培养方法：即Q旋转培养。培养瓶呈360的缓慢旋转移动，使细胞培养物保持均匀分布和保证空气供应。Q往返振荡培养。机器带动培养瓶在一直线方向往返振荡。Q旋转振荡培养。机器带动培养瓶在平行面上作旋转振动。搅动培养。利用搅拌棒不断转动，使培养基被搅动。细胞悬浮培养的类型5.1分批培养(batchculture)分批培养在小规模和大规模细胞培养中都适用，不同的是前者适用的培养容器小，而后者适用大容器的生物反应器5。通过生物反应器的培养中，为了控制PH值而进行酸碱的添加，但在培养结束之前不进行培养基成分的添加和产物的回收等。所以，由于培养基成分的浓度随时间而不断减少，所以细胞和产物的产量等受到加入的培养基成分和产生的抑制物质的积累等的影响6。在分批培养中，细胞数目增长的变化情况表现为S形曲线。培养初期悬浮细胞处于滞后期，细胞很少分裂；进入对数生长期后，细胞分裂活跃数目迅速增加；经过34个细胞世代之后，培养基中某些营养物质已经耗尽，或是有毒代谢产物的积累，增长逐渐缓慢，进入静止期后，增长完全停止7。5.2连续培养(continuousculture)连续培养是通过控制加入定量的营养物质使细胞生长率和细胞密度保持不变的一种培养方式，主要用于研究和生产次生代谢物质8。连续培养主要用于大规模细胞培养，通过添加新鲜培养液和排放已利用的培养液来平衡营养水平，使培养细胞长期处于静止期状态。连续培养又分封闭式和开放式连续培养。两者的区别是，前者排放出的培养液中有培养细胞，将这些细胞收集后又置于原容器中培养，所以培养细胞能持续增加；后者排放出的培养液也有培养细胞，但不将培养细胞放回原容器。开放式连续培养有2种类型，即通过恒化器的连续培养和通过恒浊器的连续培养9。连续培养中伴随着长期的培养操作。所以在连续的新鲜培养基的供应和长期的氧供应、细胞送回操作等中杂菌污染的危险性增大10。5. 悬浮培养细胞的同步化细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期11。由于植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。但通过一些物理和化学处理，可以使细胞同步化状态获得一定程度的改善，实现部分同步化。6.1物理方法6.1.1体积选择法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中，从而可能保持相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。这种方法的优点是操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，因而不会有其它处理所带来的对细胞活力的影响12。6.1.2低温处理法冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。收集细胞，在4摄氏度温度下处理数天，添加新鲜培养液。6.2化学方法6.2.1饥饿法饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，而导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。当在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可以重新恢复。饥饿导致的细胞分裂受阻，常常使细胞不能合成DNA，即不能进入S期；或细胞分裂不能进行，即不能进入M期13。6.2.2抑制法通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期G1期的同步化细胞14。国内悬浮培养技术产业化存在的挑战和展望7.1国内悬浮培养技术产业化的挑战国际上反应器悬浮培养技术已广泛用于生物制药生产，且在高表达细胞株的构建、个性化培养基的研发等方面不断发展。大量新建反应器和产物表达量的提高已导致反应器容量过剩，发达国家市场出现饱和、向发展中国家扩展的趋势。各大生物制药巨头开始通过合作或购并等方式进入新兴的中国市场。制药巨头赛诺菲-安万特看中中国兼具研发和新兴市场这两种特质，在药品研发、生产、包括动物疫苗生产等领域在中国进行了大量投资；而诺华公司则在2009年底，通过收购中国第二大甲流疫苗供应商浙江天元生物股权，快速进军中国疫苗行业。7.2展望应该认识到，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的应用只是搭建了一个升级的工艺平台，而不是最终目的，行业和企业发展真正的动力是新药、新疫苗、新工艺以及配套技术的创新。例如：无血清培养病毒生产技术的开发，包括无血清培养基的开发；利用合适的培养基和转染或驯化技术实现贴壁细胞的悬浮培养构建；新宿主细胞表达品种开发，如同一种产品采用新的宿主细胞表达或是开发一种高效表达的宿主细胞适应几种产品的表达；利用基因工程技术，开发更安全的疫苗品种；以及生物制品相关的关键技术和产品国产化，如个性化细胞培养基、生物反应器、微载体、纯化装置、佐剂等。参考文献1、谢从华，柳俊，植物细胞工程，高等教育出版社，2004,pl30-1312、李胜，李维，植物组织培养原理与技术，化学工业出版社，2008，p1673、肖尊安，植物生物技术，化学工业出版社，2005，p834、周维燕，植物细胞工程原理与技术，中国农业大学出版社，20015、佐天榮三，小林猛，本多裕之：生物工学序，p1146、日本生物工会学，生物工程，科学出版社，2008，p365-3667、潘瑞炽，植物细胞工程，广东高等教育出版社，2006，p978、小林猛，本多裕之：生物化学工学，p98，东京北学同人(2002)9、姬研茹等，生物技术通报，2005，p4110、小林猛，本多裕之：生物化学工学，p92，东京北学同人(2002)11、李宝健，曾庆平，植物生物技术，湖南科学出版社，1990，p25612、李志勇，细胞工程，科学出版社，2006，p5613、司徒镇强，吴军正，细胞培养，世界图书出版公司，199614、刘国民等，实用植物组织培养技术教程，甘肃科学技术出版社，200215、林世康，胡云龙，施国民，动物细胞无血清培养基的应用及研究进展J/OL,细胞生物学杂志，2000年03期16、陈志南，杨向民，基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术J/OL，中国医药生物技术，2009年10月第4卷第5期