实验七+人体外周血淋巴细胞培养

实验五 人的外周血淋巴细胞培养一、实验原理外周血液中的小淋巴细胞,几乎都处在1期（或Go期）,一般情况下是不再分裂的,在培养液中加入植物凝血素(PH) 时,这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞,随后进入有丝分裂。这样经过短期培养,秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。二、实验目的掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法.三、实验材料人的外周血.四、实验器具和药品1用具:2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶,试剂瓶,酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒,天平，离心机，恒温培养箱，显微镜.器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前,均应用肥皂水洗刷，清水冲净,烘干后浸泡在洗液中至少，再用流水冲洗,烘干待消毒。将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；1501h。隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒（5磅1min）.3药品（） RPMI“14”培养基：称取“1640粉末10。5克，用10l的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时,可用干冰或CO2气体处理，如H值降至6。0时，则可溶解而透明。每100ml溶液加NaCO,1。01。g,以干冰或O2气体校正p至72。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。(2） 肝素:作为抗凝剂使用.称取该粉末10g(每m含126U)，用0ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 0U.高压消毒8磅15min。（3） 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素mg,用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤,然后放入冰箱4保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0.050.1ml加入ml的培养物中,其最终浓度为0。48gml。(4) 植物凝血素(PH)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PH的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末.如用之得当,二种方法均可获得良好的效果。盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色。黄色，白色的四季豆亦可.取豆子2g,用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4),次日倒去水分,将豆子放入组织搅碎器内,加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70m生理盐水，混合均匀。置冰箱24h.然后以3000转mn离心15min,取上清液,用生理盐水稀释0倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶,冰冻保存。酒精乙醚提取法：四季豆50g,先用生理盐水洗净。将豆浸入60l盐水中，保存于4冰箱内,2h后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加10m盐水，置4冰箱中24h，取出后以6000转i离心0mn，吸取上清液，调pH至5。6（用0.1ml C调)之后,每100ml上清液加4ml无水酒精，加以搅拌，以3000转m离心15mi，取上清液，弃去沉淀。在每100ml上清液中加170ml10乙醚无水酒精（10ml乙醚十0ml无水酒精）以000转mi离心5min,取沉淀放入培养皿中,在含有硅胶的抽气干燥器中抽气2-4,沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末,以05%NaCl液配成1的溶液,此PHA溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中，冰冻保存。使用时每5m培养物加0.1ml即可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作，那么配成的PA溶液便无需用细菌滤器过滤.(）抗菌素青霉素(以每瓶40万U为例)： 以4M生理盐水(或培养基）稀释，则每M含10万U.取1m加入100ml培养基中,则最终浓度为00U/l.链霉素(以每瓶50万U为例）:以2m生理盐水(或培养基)稀释，则每l含25万U。取0.ml（含0U）加入100m培养基中，则每l含100U（即00g).（100万U=lg,lg=1106g）。（）姬姆萨染液：0.g姬姆萨粉末，加m纯甘油,在研钵中研细,放在56恒温水浴锅中保温90in，再加入33l甲醇，充分搅拌,用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中保存,作为原液。用时以磷酸缓冲液(pH7。4）1：1稀释。(7)0.1mlL磷酸缓冲液: pH7.。A。 Na2PO41H0 28.KH2PO4（无水） 2.67溶解于10ml双蒸水中。B. N2HP470 2164NaH2420 .g溶解于1000双蒸水中。五、实验步骤1培养液的分装：在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各试剂分装入培养瓶,每瓶量为：培养液（RPIl640或9） 4m小牛血清 llPHA 。2l肝素 00ml双抗（青霉素加链霉素）培养液中最终浓度各为：100Ul用3。NCO调p到.27。4,分装到20m的玻瓶中，用橡皮塞塞紧,待用或置于条件下保藏.用前从冰箱内取出，放入37恒温锅中温育10min.2.采血：用2ml灭菌注射器吸取肝素(50U/m）005ml湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约0ml，在酒精灯火焰旁,自橡皮塞向培养瓶内(内含有生长培养基5ml）接种，轻轻摇动几次,直立置70。恒温箱内培养。 。培养:置37温箱内培养672h。秋水仙素处理:培养终止前在培养物中加入浓度为40g/ml的秋水仙素0.050。ml，最终浓度为0。40/m，置温箱中处理24h.5.低渗处理：低渗液的种类较多，如.07moL的KCl溶液,0.9的枸橼酸钠溶液，用蒸馏水稀释4倍的ans液,也可直接用蒸馏水.秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶,用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育的低渗液5毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液,装入离心管中置37温箱内处理2min,使红细胞破碎，白细胞膨胀。离心: 以每1000rpm/mn,离心5mi，弃去上清液，收集白细胞。固定：固定液为甲醇：冰醋酸：1。每只离心管中,加入固定液-ml,片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15in后，离心，吸弃上清液，留下白细胞。8再固定：加入固定液2ml,用吸管轻轻打散，室温下继续固定5min(过夜也可以）.9。再离心：除去上清液,留下白细胞制片.10.制片： 向上述离心管中滴入固定液。毫升，用滴管小心冲打成悬液，从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片，每片滴加悬液13滴,用嘴轻轻吹散,用电吹风吹干,或在酒精灯火焰上微微烤干。1.染色:用磷酸缓冲液（pH7。4）稀释后的姬姆萨染色液染色0min,然后倒去染液,用蒸馏水轻轻冲洗。2镜检：待稍午后,在显维镜下检查.先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。3. 封片：用加拿大树胶封片.选择染色体清晰,分散度好 的细胞进行显微摄影，进行核型分析（见图20).图21 人体外周血培养与染色体标本制作示意图六、实验注意事项1。接种的血样愈新鲜愈好,最好是在采血后24h内进行培养,如果不能立刻培养，应置于4存放，避免保存时间过久,会影响细胞的活力。2在培养中成败的关键,除了至为重要的PH的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37+0.5。培养液的最适pH727.4。培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡厂使凝块散开,继续放回3恒温箱内培养。4.制片过程中,如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开；可将固定时间延长数小时或过夜.七、实验结果1 核型分析:人类每个体细胞有46条染色体，2对常染色体和一对性染色体,男子是6,XY女子是4，(见图202）。 图202 人淋巴细胞染色体（， XY)求取以下三个参数：（1） 染色体的相对长度=（2)臂比率=()着丝粒指数=可以将人的4条染色体分成A、B、D、E、G七组，作为进一步识别和鉴定染色体的依据。参考文献项维，吕曼硎,7（16），科学通报，科学出版社,北京。文中如有不足，请您指教！5 / 5