生物：3.1酶的制备及活力测定课件(中图版选修1)

3.1 3.1 酶的制备及活力测定酶的制备及活力测定实验目的和要求1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。2.掌握过氧化物酶的活力测定方法。辣根过氧化物酶的制备及活力测定辣根过氧化物酶的制备及活力测定过氧化物酶催化以下反应 2H 2 O 2 O 2+2H 2 O 这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，简称HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质,Mr在40 000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E 0=-0.2070V，pH为7.71时，E 0=-0.2787V。1.RZ值：提纯工作的后几步，以及纯酶溶液可用RZ值表明酶的纯度。RZ=A403nm/A275nm，403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的RZ值为3.04。测定时的酶浓度为1mg蛋白/mL。2.愈创木酚法：测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连酚生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度有关。本实验是采用测定 k4的方法来判断酶的纯度。一、HRP的制备 1.水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎12次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测得总体积。2.硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1 000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度，0)，大约在12h内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3 000r/min离心15min，弃沉淀，合并上清液。再按每1 000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13 000r/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析12天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换23次，用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀，量上清液的体积。3.丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至15的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)15丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。4.精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3 mol/L，5 000r/min离心10min，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的RZ值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。二、HRP的活力测定 1.活力测定：测定k4值的方法操作如下：取2个比色池(带盖，光程1cm)，按表加入反应物。对照样品反应物磷酸盐缓冲液2.91mL 2.90mL 愈创木酚溶液0.05mL 0.05mL 酶液0.0mL0.01mL酶液：将1mg蛋白/mL的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后使用。加好反应物，摇匀，在 470nm读出A470nm值，为t=0时的读数。立即加0.01mL40mmol/L过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔30s读数1次，约5min，并记下实验时的室温。将所测样品的 A470nm值减去相应时间对照的A470nm值，然后以A470nm值为纵坐标，时间为横坐标作图，得一直线，计算出平均每分钟光吸收的增加，即求出x/t，按公式(8)求出k4值。或不求k4值，而把在上述条件下，每分钟A470nm增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位。2.蛋白质含量的测定：将酶液适当稀释后，用Bradford法比色测定蛋白质含量，1.计算产品的RZ值及k4值。2.计算产品的比活力。1.盐析法制备辣根过氧化物酶的原理是什么?2.愈创木酚法测定辣根过氧化物酶的原理是什么?3.测定辣根过氧化物酶的活力时，要求什么样的pH和 温度?是否需要先测定酶液的蛋白质含量?凤凰平台 http:/ twd36twu 一定不会少给的！”耿正说：“倘若如此，我们一定认真履约！”老板听了很高兴，又说：“还有，在我们酒店献艺期间，你们每日上午来酒店的时间不可以晚于午时初，午饭和晚饭酒店里免费提供，晚上离开酒店的时间通常不会晚于戌时中；如果晚于这个时间，酒店将现送数量不等的小费。”耿正说：“谢谢，我们一定会在每日的午时初之前来酒店上班！”老板再次依次看过眼前这举止不俗的兄妹三人，非常有礼貌地问：“请问各位贵姓，怎么称呼啊！”耿正说：“免贵姓耿，我叫耿正，妹妹叫耿英，弟弟叫耿直。”老板连声说：“好名字，好名字啊！”耿英说：“请老板放心，我们一定会在贵酒店用心献艺的！”老板更高兴了，挥手招呼周围的伙计们：“你们都过来和这兄妹仨认识一下吧，以后可要多照应他们啊！”事实上，老板对原先经常来该酒店献艺的几个艺人都不是十分满意，因此并不曾与哪一个艺人签署过任何形式的聘用契约。他们只是随意来随意走，哪一个先到了就在这里做一次。后到的没有位置了，就转到其他的酒店另行招揽生意去了。至于酬金，虽然给得很够意思，但也都只是以小费的形式当日交给就是了。此外，酒店里也从来不为他们提供任何饭菜，只不过吩咐伙计们给以茶水照顾和礼貌接待而已。今日提出来要与耿正兄妹三人签署聘用契约，不过是该老板的突发奇想而已。这个独具慧眼的精明人看出来，这兄妹三人肯定能给自己的酒店带来丰厚的回报，因此不但想要留住他们，而且还要约束他们没有机会再去其他的酒店展现才华。十天的试用期圆满结束了，耿正兄妹三人组成的拉奏演艺说唱班取得了空前的好效果，“盛元酒店”的上座率日日增加！来这里吃饭的客人，一帮接着一帮在酒店门口排长队等候。老板对耿正兄妹三人刮目相看，提出来愿意以每月三十两纹银的高薪，与他们签署长期聘用契约，并慎重地征求耿正的意见，看他们兄妹三人到底愿意与酒店签署一份多长时间的契约。耿正和耿英商议后认为，在酒店献艺期间除了每日需要自掏腰包吃简单的早餐之外，再没有其他消费了。因此，只要做满了三个月以后，积攒的银子就足够做一个小本的买卖了。虽然在这个大酒店献艺确实是无本大利，但他们不想长期做这个。于是，耿正郑重地对老板说：“多谢老板器重，我们想先签署一份三个月的契约！您看如何？”老板有点儿不解地问：“只签三个月？”耿正说：“是，三个月！”老板想一想，爽快地说：“行，那就先签三个月吧。三个月的契约期满后，咱们再商量续签的事情！”当下，老板就当着耿正兄妹三人的面，亲自口授，让柜台的账房先生拟定，并誊写了完全相同的两份为期三个月的聘用契约，由他自己和耿正分别签字画押以后，双方各执一份。然后，他又