八章园艺植物生物技术4ppt课件

主要内容 文库筛选法 图位克隆技术 转座子标签法 基因差异表达技术 同源序列法 基因芯片技术第一节 文库筛选 园艺植物基因组文库的构建 园艺植物cDNA文库的构建 目的基因的筛选一、园艺植物基因组文库的构建(一)基因文库的定义及类型1.定义 一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。2.类型 基因组文库基因组文库:植物基因组全部DNA片段组成的基因文库,反映基因组的全部遗传信息。cDNA文库文库:将某一特定组织表达的mRNA反转录成cDNA组成的基因文库，每个克隆只含1种mRNA信息,足够数目克隆则包含细胞全部mRNA信息。cDNA便于克隆和大量扩增,不像基因组DNA含有内含子很难表达。一、园艺植物基因组文库的构建(二)构建的植物基因组文库需要满足的条件 文库能够覆盖整个基因组;插入的DNA片段比较大;文库易于保存且较稳定一、园艺植物基因组文库的构建(三)载体的制备 1.完整的基因组文库所需要筛选的重组子数目 N=In(1-P)/In(1-f)N,重组子的数量;P,所要求的概率;f,某一插入片段与相应生物基因组大小的比值.要以0.99的概充获得番茄基因组(9.5108bp)20kb的插入片段,所需要筛选的重组子数为:N=In(1-0.99)/In1-(2104/9.5108)=2.2105 2.载体的选择 a)质粒载体可承载15kb DNA左右片段(有效范围为10kb)b)载体可承载25kb DNA左右片段(有效范围为15kb)c)Cosmid载体可承载45kb DNA左右片段(有效范围为40kb)一、园艺植物基因组文库的构建 3.载体制备 要求:纯度高,去磷酸效果好 去磷酸化是为了提高载体和目标片段的连接效率 纯度如果不高则会在重组克隆中含有大量的细菌基因组DNA,影响文库的质量.一、园艺植物基因组文库的构建(四)大片段基因组DNA的制备 要求:一般提取的DNA相对分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3-5倍 如插入片段达到100kb以上,则要求提取的基因组DNA 分子量要达到500kb以上 实践证明:提取的基因组DNA分子量越大,得到的重组克隆的插入片段越大一、园艺植物基因组文库的构建 基因组DNA 的不完全酶切 1.根据实验需要选择合择的限制性内切酶 1)四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256 2)六个识别位点的限制酶出现的几率:1/4096 2.分离目的酶切片段大小的确定 1)克隆单个基因:10kb 2)克隆基因族:20kb一、园艺植物基因组文库的构建 基因组DNA 的不完全酶切 3.DNA不完全酶切条件的确定 1)确定限制酶用量,改变酶切时间 2)固定酶切时间,改变限制酶的用量一、园艺植物基因组文库的构建DNA的不完全酶切(五)大片段DNA(酶切片段)与克隆载体连接 1.酶切片段的分离与纯化 1)低熔点琼脂糖回收目的片段 2)试剂盒回收目的片段一、园艺植物基因组文库的构建(五)大片段DNA(酶切片段)与克隆载体连接 2.克隆载体连接 连接体系中的四种连接方式:载体自连;载体和基因组DNA片段连接;基因组DNA片段的自连和基因组片段之间连接 只有基因组DNA和载体之间的连接才是所需要的,如何提高它们之间的连接效率是连接反应的关键.可以通过调整载体与基因组DNA的比例来达到较好的效果.(载体与外源片段的比例为1:5-1:15)一、园艺植物基因组文库的构建基因组DNA片段3凹端的不完全补平的策略(六)载体的遗传转化 电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段 插入片段越大，转化效率越低(七)克隆的挑取、验证 从文库中随机挑选一定量的克隆，摇菌，提取质粒DNA，酶切脉冲电泳检查插入片段的大小，并根据数目计算空载率。细胞器DNA的污染会降低文库的实际容载量，一般用线粒体和叶绿体的探针对文库进行检测。一、园艺植物基因组文库的构建(八)文库的扩增、分装及保存 1.基因组DNA文库的保存 1)影印滤膜保存法一、园艺植物基因组文库的构建(八)文库的扩增、分装及保存 2.文库在液体培养基中扩增保存 1)从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70储存(加终浓度为25%的甘油).缺点:因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少.一、园艺植物基因组文库的构建(八)文库的扩增、分装及保存 2.文库在液体培养基中扩增保存 2)从平板上挑选单个克隆子接各种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70或-25 下保存 缺点：需要保存的克隆子数过多，工作量大一、园艺植物基因组文库的构建二、园艺植物cDNA文库的构建 真核生物基因组真核生物基因组DNA十分庞大十分庞大,其复杂程度是其复杂程度是mRNA的的100倍左右，而含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的倍左右，而含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个休中，都只有或个休中，都只有15%左右的基因得以表达，产生约左右的基因得以表达，产生约15000种不同的种不同的mRNA分子。可见，由分子。可见，由mRNA出发的出发的cDNA克隆克隆,其复其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建1.纯化mRNA样品的制备 选择特定发育阶段的特定组织为分离mRNA的材料。mRNA的纯化：利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴与olgo(dT)互补杂交,使mRNA固定在固相介质上,再将mRNA洗脱下来,制备出纯属化的mRNA样品.mRNA样品完整性的检测:根据28S和18S rRNA电泳条带的亮度判断RNA的完整性，从而间接地判断mRNA的完整性。mRNA纯化二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建2.cDNA第一链的合成关键是获得大量完整的cDNA拷贝影响因素：模板mRNA的质量、反转录酶、引物。反转录酶：禽源(AMV)和鼠源反转录酶(M-MuLV)。AMV：除具有DNA聚合酶活性外，还有很强的Rnase H酶活性。M-MuLV:Rnase H活性比AMV低,但反转录效率比AMV低。Superscript反转录酶:除去了MMLV的Rnase H活性,更能保证cDNA第一链的全长和高产。引物常用oligo(dT)和随机六聚体核苷酸。二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建3.双链cDNA的合成自身引导合成法利用新合成的单链cDNA 3末端反转所形成的发夹的双链部分作为引物，引导DNA聚合酶以cDNA为模板，合成互补的第二链cDNA，反应结束后，用S1核酸酶降解发夹环的单链部分，即可得到双链的cDNA片段。主要缺点是在用S1核酸酶去除发夹环时的反应条件要求极为苛刻，难以控制，目前已极少采用。二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建3.双链cDNA的合成置换合成法利用Rnase H将杂交双链中的mRNA降解,形成多段仍与cDNA第一链保持杂交的RNA片段.利用这些RNA片段作为引物,引导合成第二链cDNA.随着合成产物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作为引物的RNA片段均被新合成的互补链所置换.通过DNA连接酶作用,将各段互补链连接成完整DNA链。除去残存的5末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3端突出的单链cDNA,得到一个双链形式的cDNA片段.该方法直接利用第一链反应产物,避免了中间处理和纯化过程造成的cDNA损失,是目前合成cDNA第二链的常用方法.二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA的合成3.双链cDNA的合成同聚物引导法在第一链的3端用末端转移酶加上一段同聚体dG。以oligo(dC)为引物合成第二链.该法最大的缺点是获得的cDNA5端上游有一段dG:dC残基,可能会抑制表达过程中DNA的转录.但该法在最佳条件下可高交克隆mRNA的5端序列.二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建4.双链cDNA的克隆cDNA的修饰为了提高双链cDNA片段与载体的连接效率,需要对cDNA进行修饰,即给平端的双链cDNA片段添加衔接头。所谓衔接头是人工合成的含有限制酶酶切位点的短双链DNA片段，或者一端为限制酶粘性末端的双链DNA片段。用前一种衔接头连接后，为了避免限制酶对cDNA片段内部可能出现的酶切位点的切割,在添加衔接头之前,文库cDNA需经甲基化酶处理。添加后一类型的衔接头时，不必对文库cDNA进行修饰.合成接头和衔接头二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建 4.双链cDNA的克隆 cDNA的克隆 将制备的cDNA成功克隆到载体中去的关键问题是cDNA和载体的比例.必须寻找一个适当的比例以避免单个重组体中含有多个串联cDNA分子或产生过高的非重组背景.为提高连接反应效率,可在连接混合物中加适量PEG 8000.建成的cDNA文库一般应进行效价测定并扩增,以利多次筛选并长期保存.cDNA文库构建流程示意图二、园艺植物cDNA文库的构建(一)普通cDNA文库的构建 6.普通cDNA文库存在的主要不足 低丰度表达序列在文库中出现的几率很低,要想得到低丰度表达基因,至少要筛选106个克隆.构建普通cDNA文库所需的mRNA量比较大,达到数微克.筛选普通cDNA文库的工作复杂,需要很长时间,限制了基因克隆的速度.二、园艺植物cDNA文库的构建(二)新型cDNA文库的构建 1.PCR介导的cDNA文库 原理:以cDNA第一链为模板,设计一组引物,通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。优点：增加低丰度mRNA的克隆机会;利用仅有的几个细胞或微量的mRNA建立较大的cDNA文库。缺点：PCR合成的片段一般较短，大片段的全长扩增困难；扩增过程中错误掺入率甚高；由于PCR对短片段的扩增效率高于长片段，故mRNA的原始丰度难以在文库中体现。应用：适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因。(二)新型cDNA文库的构建 2.标准化cDNA文库 定义:某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中,且含量相等的cDNA文库。优点：增加了克隆丰度极低的mRNA的机会。能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录区。能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因。二、园艺植物cDNA文库的构建二、园艺植物cDNA文库的构建(二)新型cDNA文库的构建 2.标准化cDNA文库 构建方法 用基因组DNA做选择杂交,所捕获的cDNA丰度与对应的基因组DNA丰度一致,其缺点是约20%的非单一拷贝基因在构建的文库中丰度偏高。根据cDNA退火的二级动力学特征，即稀有拷贝的cDNA较丰度拷贝的cDNA复性或杂交慢,使未复性部分的单链cDNA渐趋等化。二、园艺植物cDNA文库的构建(二)新型cDNA文库的构建 3.染色体或区域特异性cDNA文库 用某一染色体或基因组区DNA与合成的cDNA池或已构建的cDNA文库杂交,将捕获的cDNA进行PCR扩增,便可构建染色体或区域特异性cDNA文库。其中的cDNA或定位于该染色体上或与之有同源性。染色体显微切割技术的发展使得构建的文库更狭窄，更具特异性。二、园艺植物cDNA文库的构建(二)新型cDNA文库的构建 4.消减cDNA文库 又称差示文库,常用于克隆不同组织或同一组织在不同的生理状态下表达有差异的基因.在一定条件下用过量不含目的基因的驱动(driver)与含有目的基因的试验方(tester)进行杂交,将含有目的基因的未杂交部分收集后构建相应的文库。由于消减cDNA文库的富集作用,使所需筛选的克隆数减少几十到上百倍.基因组基因组DNA文库与文库与cDNA文库的比较文库的比较基因组DNA文库的优点 相对于cDNA文库,基因组文库的优点:cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构,没有包括基因组的间隔序列;cDNA文库中,不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态,即:高丰度mRNA的cDNA克隆,所占比例较低,分离基因困难;从cDNA克隆中,不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。cDNA文库的主要优点cDNA文库以mRNA为材料,特别适用天某些mRNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离.cDNA文库的筛选比较简单易行。每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列,这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低,因此,阳性杂交信号一般是有意义的,由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因.cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆,直接应用于基因工程操作.cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究.cDNA克隆的主要缺点 cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库,并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息,但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。在cNDA文库中,相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高,分离起来比较容易,而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低,因此,分离也就比较困难。三、目的基因的筛选 1.根据目的基因的核苷酸序列筛选 根据基因序设计引物,以基因组DNA或mRNA反转录的cNDA为模板进行PCR扩增.如果得到的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作为探针筛选cDNA文库和基因组文库获得全长基因.用探针直接筛选库,若能得到其它植物已分离的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA文库和基因组文库,获得研究植物的目的基因.三、目的基因的筛选 2.根据目的基因的核苷酸序列筛选 如果已知基因表达产物(蛋白质)的氨基酸序列,就可以反推出原来基因的核苷酸序列。从N端对10多个连续的氨基酸进行序列测定，选择连续6个以上简并程度最低的氨基酸，按各种可能的序列结构合成寡核苷酸探针库，从cDNA文库和基因组文库中筛选全长的基因.缺点:在实验中得到纯度高、数量足够的目的基因表达产物(蛋白质)是很困难的,蛋白质测序也花费较高,难度较大.三、目的基因的筛选 3.PCR法筛选基因文库 将基因文库分装96孔培养板.培养一段时间后，分别从同一行或同一列孔中吸取少量培养物合并。以此混合物为模板进行PCR扩增，根据凝胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆。对含有阳性克隆的行或列孔中培养物再次分装，经培养后进行第二轮PCR扩增。如此反复操作，直至获得阳性克隆。第二节 图位克隆技术 一、分离基因的程序 二、优缺点一、分离基因的程序(一)图位克隆技术的定义及原理 定义:根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法.原理:首先找到一个是以与目标基因相连的DNA分子标记,然后通过染色体步移技术克隆分离出目标基因.当基因与标记之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小时,就要可直接筛选到含有目标基因的克隆,这种方法称为染色体登陆(chromosome landing)一、分离基因的程序(二)分离基因的程序 目的基因的初步定位 利用分子遗传图谱确定与目的基因连锁的分子标记。目的基因区域的物理作图 将分子标记之间的遗传距离（cM）转化为物理距离(碱基数),构成该基因区域的物理图谱.构建并筛选含有大插入片段的基因组文库.用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选大片段基因组文库，获得阳性克隆。一、分离基因的程序(二)分离基因的程序 构建目的基因区域跨叠克隆群 以阳性克隆的末端作为探针筛选基因组文库，获得含有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠群 目的基因的精细定位和染色体登陆 以目标基因两侧的分子标记为探针，通过染色体登陆获得含目标基因的阳性克隆。外显子的分离和鉴定 利用筛选cDNA文库,外显子捕捉等技术获得候选基因，通过功能互补实验确定目标基因。二、优缺点主要应用于基因组较小、分子标记连锁图密度较高和转化系统比较稳定成熟的植物。对于基因组较大，重复序列较多的园艺植物，图位克隆法要步移大量的DNA片段，投资大，效率低；而DNA大片段插入文库含有许多嵌套克隆或克隆后的重排现象等原因，使得染色体步移十分困难。对于这些植物，可以通过构建高密度的分遗传图谱和寻找物理距离目的基因很近的分子标记，使得染色体步移的距离大大缩小。第三节 转座子标签法 一、转座子的分类 二、分离基因的程序 三、优缺点 四、T-DNA标签法一、转座子的分类（一）转座子的定义与功能 1.定义 染色体上一段可以移动的DNA序列，可以从一个基因座位转移到另一个基因座位。2.功能 当转座子插入到某个功能基因的内部或邻近位点时，就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型；而当转座子切离时，又使目的基因恢复活性。一、转座子的分类（二）转座子的分类 1。DNA转座子 通过DNA复制和直接切离两种方式获得可转移片段，重新插入基因组DNA中。2。反转录转座子 由RNA介导的转座子，即作为DNA的转座子首先被转录为RNA，再借助反转录酶反转录合成DNA，插入到新的染色体位点来实现转座过程的。二、分离基因的程序 采取农杆菌介导等适当转化方法反转座子导入目标植物，设法将转座子插入到目标基因内部或邻近位点，引起表型突变。通过表型筛选获得纯合突变株。构建纯合突变株的核基因组文库。以转座地子片段作为探针，从该基因组文库中筛选含转座子片段的克隆。以该克隆作探针，筛选另一正常植株的核基因组文库，获得完整的正常目的基因。三、优缺点 优点：利用转座子标签法可在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下分离植物基因。局限性 该技术的前提条件是要筛选出转座子插入的突变体。在实际操作中，由于转座频率往往很低，因此，需要筛选的突变体群体较大。对于那些须在特定环境或特定发育阶段才有突变表型的基因，往往由于看不到明显的突变表型而被忽略。由于基因的功能补偿等机制的作用，即使有些基因产生了插入突变，也可能看不到突变表型，因而不能运用该方法。T-DNA标签法 原理：T-DNA能够从农杆菌中转移并稳定地整合到植物宿主的基因组中，从而使整合位置上的基因失活或产生突变，通过T-DNA上的标记基因（如GUS等基因）就可检测突变位置，得到与T-DNA相连的DNA片段，以此制备探针筛选野生型基因文库，就可得到与突变相应的完整基因。缺点 由于T-DNA的可移动性，不易获得较稳定的突变遗传系。由于高等植物基因组中大量的重复序列存在，也降低了获得目标突变体的效率，实验周期较长。第四节 基因差异表达技术 一、mRNA差异显示技术 二、抑制性消减杂交技术 三、代表性差异分析法 四、基因表达系列分析 五、cDNA-AFLP技术一、mRNA差异显示技术 1.原理 根据大多数真核细胞mRNA的3端具有poly(A)结构,利用含oligo(dT)的寡聚核苷酸作为引物，将总mRNA反转录为cDNA,然后通过PCR技术和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异cDNA片段,从而筛选出目的基因.一、mRNA差异显示技术 2.基本步骤 从不同植物或组中提取总mRNA.用oligo(dT)12MN为引物(其中,M=G/C/A,N=G/C/T/A),在反转录酶的作用下,将mRNA反转录成 cDNA.用与反转录相同的锚定引物和由10个碱基组成的随机引物对生成的cDNA进行PCR扩增.PCR扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳道上分析,找到差异表达的cDNA条带.加收差异表达的条带,将其作为探针进行Northern杂交或筛选cDNA文库,获得差异表达的基因全长.一、mRNA差异显示技术 3.优缺点 优点 在基因序列未知的情况下，直接用来鉴定和克隆差异表达基因，具有简便，快速，RNA用量少，效率高等优点。主要用于比较两种以上特定生理状态或不同发育阶段的mRNA样品间基因表达的差异.缺点 假阳性特别高，可达70%，增加了后续工作的难度。由于PCR的敏感性，mRNA差异显示技术重复性较差.扩增片段较小(110-500bp),不能代表差异表达的基因.只能扩增靠近Poly(A)mRNA3端不大于600bp的区域。对高拷贝mRNA有较强的倾向性，不能用于低拷贝的mRNA.二、抑制性消减杂交技术 1.原理 以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交.所谓抑制PCR是利用非目标基因片段两端的长方向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。二、抑制性消减杂交技术 2.基本步骤 提取含有目的基因的待测组织(tester)和不含目的基因的对照组织(driver)的mRNA,并反转录为cDNA.用限制性内切酶将两种不同的cDNA切割为小片段.将test cDNA分为两份,分别连接不同的接头。用过量的driver cDNA分别与这两种test cDNA进行第一次消减杂交,会产生:单链tester,双链tester/tester,双链tester/driver,单链driver及 双链driver/driver二、抑制性消减杂交技术 2.基本步骤 混合两份杂交样品,并加入新的变性driver cDNA进行第二次消减杂交,从而形成一种新的杂交组分,即分别含有不同接头的双链cDNA分子(tester-adaptor 1/tester-adaptor 2).补平变性后分子的黏性末端.以接头1和接头2序列为引物对其进行第一轮PCR。用与接头内侧序列互补的另一对引物进行第二轮PCR，富集差异表达的目的基因片段。用第二轮PCR产物构建相应的差减cDNA文库，克隆差异表达基因。二、抑制性消减杂交技术优缺点优点：假阳性率大大降低，阳性检出率为50%以上；目的序列富集程度较高，且丰度相对一致，确保了低丰度表达的cDNA有被检测的可能极大地提高了检测效率;灵敏度高,重复性强.缺点:需要较多的起始材料的mRNA,因而某些特殊样本不容易获得;更多地依赖于PCR技术;不能同时对数个材料进行比较;材料之间存在的过多差异及小片段缺失也不能有效地被检测.三、代表性差异分析法 1.原理 以差减杂交为基础，从基因组水平筛选和克隆基因的方法；充分利用了PCR反应中双引物以指数形式扩增双链模板，而单引物仅以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法,特异地扩增目的基因片段.三、代表性差异分析法 2.基本步骤 分别提取试验组T和驱动组D的RNA并反转录成cDNA,然后加上接头，以接头特异性引物进行PCR扩增。扩增产物经限制性内切酶切除去接头后，给T组酶切产物连上新的接头，使之区别于D组的cDNA.用过量的D组酶切产与经修饰过的T组cDNA混合,经变性,退火复性后形成T-D异源杂交分子,T-T同源杂交分子和D-D同源杂交分子.利用T组新接头的特异接头引物时行PCR扩增,T-T同源杂交分将得到有效扩增.重复2-3次差异杂交步骤,尽可能去除共有序列，对差异表达基因片段进行更有效的富集。克隆差异表达基因.代表性差异分析法示意图三、代表性差异分析法 优缺点 优点：免去了物方法分离单，双链的繁琐操作，通过接头修饰设计，借助PCR技术即能使目的片段得有效扩增，减少假阳性。差减杂交在扩增后的cDNA群体之间进行,不再受供试的mRNA量的限制,拓宽了差减杂交的应用范围.一次实验可以分离得到多个在T组和D组间差异表达基因的cDNA克隆,并能发现与表型相关的异常基因,检测基因的上调和下调表达.三、代表性差异分析法 优缺点 缺点:目的基因间丰度的差异在数轮差减杂交后的群体中保留了下来,在后续的筛选中,高丰度的差异基因容易得到,低丰度的差异基因不易检出，而低丰度的表达产物往往代表相对重要的基因；分离出来的差异基因也可能与其表型无关，增加了后续鉴定的工作量；对样品T组和D组的纯度要求很高，如果两组材料间差别较大，则用此方法将达不到鉴定差别表达基因的目的。第五节 同源序列法 基于同源序列的候选基因法 cDNA末端快速扩增技术一、基于同源序列的候选基因法 1.基本策略 根据已知基因的保守区设计引物，以待分离些基因的植物基因组DNA或cDNA为模板直接进行PCR扩增,对扩增产物测序并与已知基因进行序列比较,从而确定该基因是否为待分离基因。用已知序列的基因制备探针，筛选待分离基因的植物核DNA或cDNA文库.再对阳性克隆进行测序,并与已知基因序时行同源性比较,最后经转化鉴定是否为待分离的基因。一、基于同源序列的候选基因法 2.需要注意的问题 由于密码子的简并性和不同的同源序列间同源程度的差异,简并引物的特异性要设计得当.由于同源序列并不专属于某一基因家族,因而扩增产物不一定是某一基因家簇成员.基因家族成员往往成簇存，克隆的基因片段是否为目的基因需进一步转鉴定。二、cDNA末端快速扩增技术 1.基本步骤 从GenBank等公共数据库中,比较分析待克隆基因的保守序列区段。以此保守序列设计特异或简并引物，从待测植物组织的cDNA中进行PCR扩增,获得待分离基因的cDNA片段.通过RACE技术获得cDNA的5和3端,并与已知基因序列进行同源性比较.转化鉴定是否为待分离的基因。二、cDNA末端快速扩增技术 2.3RACE 利用绝大部分mRNA的3末端具有poly(A),以oligo(dT)和一个接头组成的接头引物(adaptor primer,AP)反转录mRNA,得到加接头的第一链cDNA 根据已获得的待分离基因cDNA片段设计两条特异引物GSP1(gene specific primer 1,GSP1)和GSP2，分别与已知的接头引物进行巢式扩增，从而获得该基因的3端。3RACE技术示意图二、cDNA末端快速扩增技术 3.5RACE 经典方法 用待分离基因的反向特异引物GSP反转录总RNA为第一链cDNA,在未知的cDNA的5端加上一个接头.再用GSP和接头引物PCR扩增出待分离基因的5端。环化5RACE 设计目的基因5磷酸化的反向特异引物GSP0，并在其远端(靠近5端)设计两条反向特异引物GSP1和GSP2,，在其近端(靠近3端)设计两条正向特异引物GSP3和GSP4。用GSP0反转录总RNA为第一链cDNA,然后通过T4 RNA连接酶环化cDNA,并以此环化cDNA为模板用GSP1和GSP4与GSP2和GSP3进行两轮巢式PCR扩增，从而获得待分离基因的5端。5环化RACE技术示意图二、cDNA末端快速扩增技术 4.获得基因全长的途径 一种方法是对3RACE和5RACE的产物序列的重叠区域分析，经过拼接获得全长cDNA.另外一种方法是通过分析RACE产物的3和5端序列,重新设计合成相应引物,PCR扩增出全长cDNA.二、cDNA末端快速扩增技术5.优缺点优点操作速度快,节省时间,可在短期内获得全长的cDNA。只需极少量的起始反应物质，具有快速，简便，经济，实用性强等许多优点。尤其环化5RACE无须去帽或加锚等烦琐步骤，且全部使用特异引物，因而几乎不存在产生非特异产物的可能。缺点利用RACE技术来获得全长基因经常会发生错误的扩增和克隆结果，尤其是对于丰度较低，长度较长的基因。经常出现由于引物的不匹配而导致的非特异性扩增，有时需要进行几轮巢式扩增来达到获得特异性扩增的目的，然而多轮扩增又容易提高PCR反应的错误发生率。第六节 基因芯片技术 基因芯片的类型 基本程序 优缺点一、基因芯片的原理(一)基因芯片的原理 将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后使其与待测的标记样品基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息一、基因芯片的原理(二)cDNA微阵列芯片 将克隆到的成千上万个基因的特异探针或所构建的cDNA文库内的cDNA片段固定在一块DNA芯片上.对来源于不同的个体,组织,发育阶段,或诱导处理条件下差异表达的mRNA反转录为cDNA进行检测,找出差异表达的序列.以差异序列设计探针即可从文库中筛选出相应的克隆,经测序鉴定就可以确定是否为新基因.二、基本程序 1.DNA阵列的构建和印制 根据研究目的选用合适的寡核苷酸，cDNA片段或特定的功能基因,构建点阵列。将所需的核酸片段原位合成于芯片上，或以大致相当的浓度，按一定的排列方式点样的特点的固相支持物（如玻片，硅片尼龙膜等）上。2.靶（待测）样品的准备 包括DNA或mRNA的分离,纯化,扩增及标记。标记的方法：在扩增的底物中加入荧光标记的寡核苷酸单体，如用Cys3和Cys5标记的dUTP。二、基本程序 3.分子杂交和检测 将标记好的样品与芯片进行分子杂交,反应结束后将洗去未杂交上的样品，用激光共聚焦显微镜检测.基因芯片上每一点对芯片表面各个点荧光信号的强弱进行定量分析,从而对结果进行判断。4.基因芯片数据的收集和分析 图像的平滑处理 图像背景的确定 样品斑点的识别 数据的提取,存贮与显示三、优缺点 1.优点 具有高度的敏感性和特异性,它可以监测几个至几千个拷贝的转录情况。具有高信息量，快速，样品用量少，用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因差异表达的研究中。2.缺点 需要大量已知DNA和cDNA片段的准确序列信息。需要高密度芯片制作的精密机械系统各操作工艺及微弱的杂交信号检出装置，芯片制作和使用成本较高。