紫外分光光度法测定蛋白质的含量

紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、 实验目的：（1）学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；二、实验原理： 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯尔比尔定律： A=abc“A”为溶液的吸光度值，“b”为石英比色池的厚度，“c”为蛋白质溶液的浓度。 紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。紫外-可见分光光度法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，如下所示：由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池对样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。三、仪器与试剂：TU-1901双光束紫外可见分光光度计、比色管、吸量管标准蛋白质溶液（5.00mg/mL）、0.9%NaCl溶液、待测蛋白质溶液四、实验步骤：1.准备工作：启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。标准曲线的制作。2. 测量工作：.吸收曲线的绘制：用吸量管吸取2mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻 度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液为参比，在190 nm400nm区间，测量吸光度。.标准曲线的制作：用吸量管分别吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5 mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度A278记录所得读数。.样品测定：取适量浓度的待测蛋白质溶液3 mL，按上述方法测定278 nm处的吸光度。平行测定三份。五、数据处理：以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收波长。 max=297nm以标准蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标样体积（mL）浓度（mg/L）吸光度A0.50.250.1671.00.500.3031.50.750.4412.01.000.5822.51.250.730根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。样品吸光度：0.227，0.223，0.222 蛋白质浓度（mg/L）：0.3630，0.3560，0.3540 样品蛋白质溶液浓度c=(0.3630+0.3560+0.3540)/3=0.3583mg/L六、实验注意事项：石英比色皿比较贵重，且易碎，使用时要小心；绘制标准曲线时，蛋白质溶液浓度要准确配制，作为标准溶液；测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面。七、思考题：紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法有何优缺点？受哪些因素的影响和限制？答：优点是：方法简单、灵敏、快速、高选择性，且稳定性好，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。 缺点是：仪器昂贵，而且不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的，测定结果存在着一定的误差，受光源、溶液的PH值、比色皿材质、缓冲介质溶液等因素的影响和限制。