生物化学实验方法及常用仪器介绍

生物化学实验方法生物化学实验方法 及常用仪器介绍及常用仪器介绍授课：王琼授课：王琼联系方式：联系方式：2186772（O）；）；15959252020E-mail：原料液、动植物器官、组织原料液、动植物器官、组织路线二路线二细胞细胞-胞内产物胞内产物碎片分离碎片分离路线一路线一清液清液-胞外产物胞外产物细胞分离（离心、过滤）细胞分离（离心、过滤）细胞破碎细胞破碎精制（结晶、干燥）精制（结晶、干燥）粗分离（盐析、萃取、超过滤）粗分离（盐析、萃取、超过滤）纯化（层析、电泳）纯化（层析、电泳）脱盐（凝胶过滤、超过滤）脱盐（凝胶过滤、超过滤）浓缩（超过滤）浓缩（超过滤）分离纯化一般过程分离纯化一般过程一、离心技术一、离心技术 离心（离心（centrifuge）离心是利用旋转运动的离心是利用旋转运动的离心力离心力以及物质的以及物质的沉降系数沉降系数或或浮力密度浮力密度的差异进行分离、浓的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。缩和提纯的一种方法。离心技术是利用离心力对混合液（含有固离心技术是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种技术。形物）进行分离和沉淀的一种技术。离心技术简介离心技术简介 离心分离是制备生物样品广泛应用的重要离心分离是制备生物样品广泛应用的重要手段，可以分离：手段，可以分离：活体生物活体生物（细胞、微生物、病毒）（细胞、微生物、病毒）细胞器细胞器（细胞核、细胞膜、线粒体）（细胞核、细胞膜、线粒体）生物大分子生物大分子（核酸、蛋白质、酶、多聚物）（核酸、蛋白质、酶、多聚物）小分子聚合物小分子聚合物离心技术简介离心技术简介离心技术的发展离心技术的发展1911-1912年，开始生产和使用低速（年，开始生产和使用低速（3,000 rpm以下）的商品化台式离心机以下）的商品化台式离心机 1923-1926年，瑞典年，瑞典UPPSALA大学大学Svedberg等科学家试制了世界上第一等科学家试制了世界上第一台试验型超速离心机（台试验型超速离心机（45,000 rpm）。）。1926年测定了马血红蛋白的分子量，年测定了马血红蛋白的分子量，获得诺贝尔化学奖。获得诺贝尔化学奖。1929年，年，Lamm完成了沉降方程。计算了沉完成了沉降方程。计算了沉降速度。定义了沉降系数降速度。定义了沉降系数 1940 年，年，Svedberg与与Pederson出版了世界出版了世界上第一本有关离心技术的专著上第一本有关离心技术的专著 1943年，年，Pickels研制成现代固定角式离心研制成现代固定角式离心转子转子离心技术的发展离心技术的发展离心技术的发展离心技术的发展1951年，年，Brakke在差速离心的基础上发展了速率在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。区带离心法。Kahler研制成功甩平转子；研制成功甩平转子；1955年，年，Anderson发明了区带转头，并用区带离发明了区带转头，并用区带离心法首次证明了心法首次证明了DNA双螺旋结构半保留复制的假双螺旋结构半保留复制的假说；说；1955年以后，开始了超速、高速、低速大容量离年以后，开始了超速、高速、低速大容量离心机以及分析用超速离心机的商品化生产心机以及分析用超速离心机的商品化生产1957-1959年，年，Meselson、Duve等开发了等密度离等开发了等密度离心法。心法。19641966年，年，Anderson等开始建立转子区带离等开始建立转子区带离心技术并开发了低、高、超速区带转头。心技术并开发了低、高、超速区带转头。1975年，垂直管转子被开发并用于年，垂直管转子被开发并用于Dupont-Sorvall油透平驱动的超速离心机。油透平驱动的超速离心机。1981年，美国年，美国Beckman公司开发的用于细胞离心公司开发的用于细胞离心纯化的纯化的“淘洗淘洗”转头供应市场。转头供应市场。离心技术的发展离心技术的发展 1.离心力离心力 Centrifugal force (F)F=m2r 其中：其中：m 沉降粒子的有效质量；沉降粒子的有效质量；粒子旋转的角速度；粒子旋转的角速度；r 粒子的旋转半径粒子的旋转半径(cm)=(rad/sec)离心技术原理离心技术原理 2N 60 2.相对离心力相对离心力 Relative centrifugal force (RCF)RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力离心力/F重重=m2r/mg=2r/g =(rad/sec)RCF=4 2 n2r/3600g=1.1210-5 n2r 其中：其中：n每分钟的转数每分钟的转数(rpm)离心技术原理离心技术原理从外界因素看，颗粒的沉降速度取决于离心机从外界因素看，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。的转速及其自身与中心轴的距离。2n 60只要给出旋转半径只要给出旋转半径r，则则RCF和和rpm之间可以相互之间可以相互换算。换算。由于转头的形状及结构的由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算时不一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半规定旋转半径均用平均半径径“rav”代替：代替：rav=(r min+r max)/2 离心技术原理离心技术原理3.沉降速度（沉降速度（Sedimentation velocity）指在强大离心作用下，指在强大离心作用下，单位时间内单位时间内物质运动的距离。物质运动的距离。=d2(-)g/18 Stokes方程方程 其中：其中：颗粒的沉降速度颗粒的沉降速度 d颗粒直径颗粒直径 颗粒密度颗粒密度 介质密度介质密度 介质的粘度介质的粘度 离心技术原理离心技术原理1、颗粒沉降速度与颗粒直径平方成正比，颗粒大沉降快、颗粒沉降速度与颗粒直径平方成正比，颗粒大沉降快2、颗粒沉降速度与颗粒和介质密度差成正比，密度之差越大沉、颗粒沉降速度与颗粒和介质密度差成正比，密度之差越大沉降越快降越快4.沉降系数（沉降系数（sedimentation coefficient，S）颗粒在颗粒在单位离心力单位离心力作用下的沉降速度称为该颗粒的沉降系作用下的沉降速度称为该颗粒的沉降系数，把数，把10-13秒秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或称作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或称沉降系数单位，用沉降系数单位，用S表示表示。离心技术原理离心技术原理 S (-)d218 2r式中：式中：S沉降系数沉降系数 沉降速度沉降速度 r旋转半径旋转半径 介质粘度介质粘度d颗粒直径颗粒直径 样品中颗粒的密度样品中颗粒的密度 溶剂的密度溶剂的密度 例如：例如：溶菌酶的沉降系数为溶菌酶的沉降系数为2.1510-13 s，通常叫做，通常叫做2.15 S；过氧化氢酶的沉降系数为；过氧化氢酶的沉降系数为11.3510-13 s，就称，就称11.35 S；大肠杆菌核蛋白体是；大肠杆菌核蛋白体是70 S，由两个亚基，由两个亚基组成，用超离心方法测其沉降系数分别为组成，用超离心方法测其沉降系数分别为30 S和和50 S。离心技术原理离心技术原理蛋白质的沉降系数一般在蛋白质的沉降系数一般在1-200 S之间。之间。离心技术原理离心技术原理某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的范围某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的范围样品样品沉降系数沉降系数/SRCF/g转速转速n/rpm细胞细胞10720040万万60000离心机结构离心机结构离心机分类离心机分类低速离心机低速离心机最大转速最大转速:40007000rpm最大离心力最大离心力:22209420g高速离心机高速离心机最大转速最大转速:1500026000rpm最大离心力最大离心力:16100801100g超速离心机超速离心机最大转速最大转速:55000150000rpm最大离心力最大离心力:3636009011000g分离物大小：分离物大小：150 mMicrobial cell，hemocyte，cell分离物大小：分离物大小：0.11 mMitochondria，Lysosome，cell Well分离物大小：分离物大小：0.0020.1 mDNA，RNA，Virus，Protein，Enzyme根据转速根据转速根据用途根据用途制备型离心机制备型离心机分析型离心机分析型离心机分离生物材料分离生物材料，每次分离样品，每次分离样品的容量比较大的容量比较大研究纯品大分子物质，推断其研究纯品大分子物质，推断其纯度、形状和相对分子质量纯度、形状和相对分子质量等等性质，每次分析的样品容量很性质，每次分析的样品容量很小小离心机分类离心机分类离心机分类离心机分类1、低速离心机、低速离心机 最大转速最大转速40007000rpm左右，最大相对离心力近左右，最大相对离心力近22209420g，容量为，容量为几十毫升至几升几十毫升至几升，分离形式，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常能严格控制，通常不带冷冻系统不带冷冻系统，于，于室温室温下操作。下操作。用于收集用于收集易沉降的大颗粒物质易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细，如红血球、酵母细胞等。胞等。2、高速冷冻离心机、高速冷冻离心机 最大转速为最大转速为1500026000rpm左右，最大相对离心力为左右，最大相对离心力为16100801100g，最大容量可达，最大容量可达3升升，分离形式也是固液沉，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、水平式转头、区带转头、降分离，转头配有各种角式转头、水平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统有制冷系统，转，转速、温度和时间都可以速、温度和时间都可以严格准确地控制严格准确地控制，并有指针或数字显，并有指针或数字显示。示。通常用于通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和和免疫沉淀物免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器细胞器(如核蛋白体如核蛋白体)或单个分子。或单个分子。离心机分类离心机分类3、超速离心机、超速离心机 转速可达转速可达55000150000rpm，相对离心力最大可，相对离心力最大可达达3636009011000g，离心容量由，离心容量由几十毫升至几十毫升至2升升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要离心管平衡允许的误差要小于小于0.1克克。超速离心机能使过去仅仅在电子显微镜下观察到超速离心机能使过去仅仅在电子显微镜下观察到的的亚细胞器亚细胞器得到分级分离，还可以分离得到分级分离，还可以分离病毒、核病毒、核酸、蛋白质酸、蛋白质和和多糖多糖等。等。离心机分类离心机分类依材质分类：依材质分类：铝合金：铝合金：较轻较轻,耐受强度较弱耐受强度较弱,适合在较低的转速下使用适合在较低的转速下使用钛合金：钛合金：耐受强度不错耐受强度不错,重量也比不锈钢轻重量也比不锈钢轻不锈钢：不锈钢：耐受强度最好耐受强度最好,但材质本身太重但材质本身太重碳纤维：碳纤维：具有抗各种腐蚀的能力具有抗各种腐蚀的能力，重量只有铝合金转子重量只有铝合金转子的二分之一的二分之一,钛合金转子的五分之一，使用寿命更长。钛合金转子的五分之一，使用寿命更长。离心机转子种类离心机转子种类角转子角转子 （angle rotor）甩平转子（甩平转子（swinging bucket rotor）垂直转子（垂直转子（vertical tube rotor）区带转子（区带转子（zonal rotor）连续流动转子（连续流动转子（continuous flow rotor）离心机转子种类离心机转子种类依外形分类：依外形分类：角转子：离心管放置的位置与转角转子：离心管放置的位置与转头的旋转轴之间成一个固定角度，头的旋转轴之间成一个固定角度，通常在通常在14-40之间。之间。适用于适用于差速离心差速离心，也可用于，也可用于等密等密度离心度离心。特点：容量大，转头内容纳的离特点：容量大，转头内容纳的离心管多。心管多。角转子（角转子（angle rotor）离心机转子种类离心机转子种类Drive shaft holeRotor coverPackingThread portionTube cavity离心机转子种类离心机转子种类Rotor body角转子的特点：角转子的特点：重心低重心低,转速可较高转速可较高样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径 “管壁效应管壁效应”：有一定的角度有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。在管底聚成的沉淀较紧密。离心机转子种类离心机转子种类甩平转子：离心管组装在转子的吊桶里，甩平转子：离心管组装在转子的吊桶里，离心机处于静止状态时离心管为垂直方向，离心机处于静止状态时离心管为垂直方向，即离心管与离心轴承平行方向。离心时离即离心管与离心轴承平行方向。离心时离心管与旋转轴垂直。心管与旋转轴垂直。承受的最大离心速度在承受的最大离心速度在65,000 r/min左右，左右，最大离心力在最大离心力在400,000 g。适合于适合于密度梯度离心密度梯度离心，进行差速离心效果，进行差速离心效果不理想。不理想。甩平转子（甩平转子（swinging bucket rotor）离心机转子种类离心机转子种类甩平转子运行状态甩平转子运行状态600 rpm/min离心机转子种类离心机转子种类甩平转子的特点：甩平转子的特点：转子的转子的重心位置较高，转速较低重心位置较高，转速较低 样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径对于对于多种成分样品分离多种成分样品分离特别有效特别有效 常用于常用于速率区带离心速率区带离心和和等密度离心等密度离心离心机转子种类离心机转子种类垂直转子（垂直转子（vertical tube rotor）离心机转头种类离心机转头种类垂直转子：是指离心管与旋转轴成平行方向，垂直转子：是指离心管与旋转轴成平行方向，离心管垂离心管垂直插入转子孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行。直插入转子孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行。承受的最大离心速度在承受的最大离心速度在100,000 r/min左右，最大离心左右，最大离心力在力在700,000 g。比较适合比较适合速率区带离心速率区带离心和和等密度离心等密度离心，尤其适合于质粒，尤其适合于质粒DNA 的分离纯化，但不适合于差速离心。的分离纯化，但不适合于差速离心。转头停止状态转头停止状态起始起始开始分离开始分离完全分离完全分离减速减速停止停止垂直转头的运行状态垂直转头的运行状态离心机转头种类离心机转头种类当转子旋转时，离心管中的液体层改变方向，从开始的当转子旋转时，离心管中的液体层改变方向，从开始的水平方向改成垂直方向，当转子降速时，垂直分布的液水平方向改成垂直方向，当转子降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。水平方向。为一空腔，没有离心管，样品液直接放在腔内。为一空腔，没有离心管，样品液直接放在腔内。适用于适用于大量样品大量样品的分离。的分离。最大离心速度：最大离心速度：60,000 rpm左右左右最大离心力：最大离心力：250,000g区带转头（区带转头（zonal rotor）离心机转头种类离心机转头种类由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。转子桶壁，上清液由出口流出。连续流动转头（连续流动转头（continuous flow rotor）离心机转头种类离心机转头种类最大离心速度：最大离心速度：32,000 rpm左右左右最大离心力：最大离心力：100,000g可用于大量培养液或提取可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离液的浓缩与分离塑料离心管：聚乙烯（塑料离心管：聚乙烯（PE）管、纤维素（）管、纤维素（CAB）管、聚碳酸）管、聚碳酸酯（酯（PC）管、聚丙烯（）管、聚丙烯（PP）管、异质同晶聚合物（）管、异质同晶聚合物（PA）、）、聚氧化乙烯對苯二酸聚氧化乙烯對苯二酸（PET），其中，其中PP管性能较好。管性能较好。优点：优点：透明（或半透明），易于观察；硬度小，可用穿刺法透明（或半透明），易于观察；硬度小，可用穿刺法取出梯度。取出梯度。缺点：缺点：易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢离心管：不锈钢离心管：强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀蚀。离心管离心管沉淀离心沉淀离心差速分级离心差速分级离心密度梯度离心密度梯度离心离心分离方法离心分离方法沉淀离心是应用最广的一种离心方法，一般是指介质密度沉淀离心是应用最广的一种离心方法，一般是指介质密度约约1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心的作用下完全沉淀下来。在离心的作用下完全沉淀下来。主要适宜于主要适宜于细菌等微生物、细胞细菌等微生物、细胞和和细胞器细胞器等生物材料（密等生物材料（密度在度在1.08-1.12 g/ml左右）；左右）；病毒病毒和和染色体染色体DNA等（密度在等（密度在1.18-1.31 g/ml左右）。左右）。沉降速度与沉降速度与离心力离心力和和颗粒大小颗粒大小有关。有关。离心分离方法离心分离方法沉淀离心（沉淀离心（pelleting）沉淀离心示意图沉淀离心示意图离心分离方法离心分离方法建立在建立在颗粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降系数颗粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降系数存在较大差异存在较大差异的基础上进行分离的方法。的基础上进行分离的方法。差速离心比较适用于差速离心比较适用于大小相差明显大小相差明显的细胞或细胞器的分级的细胞或细胞器的分级分离，经过多次离心可以得到满意结果。分离，经过多次离心可以得到满意结果。沉降顺序：整个细胞或细胞碎片沉降顺序：整个细胞或细胞碎片核核线粒体线粒体溶溶酶体与过氧化物酶体酶体与过氧化物酶体内质网与高基体内质网与高基体核蛋白体。核蛋白体。差速离心每次得到的沉淀物都含有极少量的小于该差速离心每次得到的沉淀物都含有极少量的小于该s值的值的沉淀物质。沉淀物质。差速离心（差速离心（differential velocity centrifugation）离心分离方法离心分离方法差速离心示意图差速离心示意图离心分离方法离心分离方法Low speedHigh speed例：一个体积为例：一个体积为100 mL悬浮液中有三种物质悬浮液中有三种物质A、B、C，沉，沉降系数分别为降系数分别为100S、10S、1S。采用差速离心的方法分离。采用差速离心的方法分离。第一步：物质第一步：物质A的沉降。的沉降。A100沉淀时，沉淀物中有沉淀时，沉淀物中有10的的B和和1的的C。多次沉淀纯化物质。多次沉淀纯化物质A。组分组分沉降系沉降系数数/S/S第一次第一次第二次第二次第三次第三次沉淀沉淀上清上清沉淀沉淀上清上清沉淀沉淀上清上清A100100010001000B101090190.10.9C11990.010.990.00010.0099第二步：物质第二步：物质B的沉降的沉降第三步：物质第三步：物质C的沉降的沉降离心分离方法离心分离方法 差速离心法主要用于分离差速离心法主要用于分离细胞器细胞器和和病毒病毒。优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：缺点是：分离效果差分离效果差，不能一次得到纯颗粒；，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使离心时间过长会使颗粒变形颗粒变形、聚集而失活聚集而失活。离心分离方法离心分离方法密度梯度离心密度梯度离心（density gradient centrifugation）速率区带离心速率区带离心（rate zonal centrifugation）分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器等密度区带离心等密度区带离心（isopycnic centrifugation）分离密度不等的颗粒分离密度不等的颗粒（区带离心）（区带离心）密度梯度离心密度梯度离心离心分离方法离心分离方法分离分离密度相近而大小不等密度相近而大小不等的细胞或细胞器。的细胞或细胞器。梯度液设计的梯度液设计的最大密度小于样品颗粒（各种组分）的密度最大密度小于样品颗粒（各种组分）的密度。离心前预先在离心管内装入密度梯度介质，离心前预先在离心管内装入密度梯度介质，被分离物质的样品被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面。溶液位于梯度液的上面。离心时样品中的组分以不同的沉降速度沉降，离心时样品中的组分以不同的沉降速度沉降，离心时间应该控离心时间应该控制在最重的样品沉淀之前制在最重的样品沉淀之前，结束时不同的组分以纯样品带方式结束时不同的组分以纯样品带方式存在于梯度液之中。存在于梯度液之中。速率区带离心速率区带离心离心分离方法离心分离方法分离分离密度不等密度不等的颗粒。的颗粒。梯度液设计的梯度液设计的密度范围正好包括所有待分离颗粒的密度。密度范围正好包括所有待分离颗粒的密度。样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。从而将不同密度的成分分离。等密度区带离心等密度区带离心离心分离方法离心分离方法速率区带离心和等密度区带离心比较速率区带离心和等密度区带离心比较分离法分离法速率区带离心法速率区带离心法等密度区带离心法等密度区带离心法原理原理沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离沉降速度的不同进行分离沉降与颗粒的密度成正比，沉降与颗粒的密度成正比，以物质的浮密度不同进行以物质的浮密度不同进行分离分离介质介质密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖密度大，如密度大，如CsCl,Cs2SO4离心力场离心力场 强，离心速度高，使被分离物质强，离心速度高，使被分离物质易沉降易沉降稍强，速度相对低，使稍强，速度相对低，使CsCl形成梯度，建立沉降形成梯度，建立沉降扩散平衡扩散平衡离心过程离心过程 样品向离心管底沉降样品向离心管底沉降不论样品起始时在什么位不论样品起始时在什么位置，离心中样品停留于介置，离心中样品停留于介质的等密度部位质的等密度部位离心时间离心时间较短，一般为几小时到几十小时较短，一般为几小时到几十小时较长，十几小时到数天较长，十几小时到数天离心分离方法离心分离方法该法的优点是：该法的优点是：分离效果好分离效果好，可一次获得较纯，可一次获得较纯颗粒；颗粒；适应范围广适应范围广，既能分离具有沉淀系数差，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。成的区带由于对流而引起混合。缺点：缺点：离心时间较长；离心时间较长；需要制备梯度；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。操作严格，不宜掌握。离心分离方法离心分离方法密度梯度溶液密度梯度溶液目前使用的密度梯度材料主要有：目前使用的密度梯度材料主要有：CsCl2,LiCl,RbCl，酒，酒石酸钾钠，甘油，蔗糖，聚蔗糖等。石酸钾钠，甘油，蔗糖，聚蔗糖等。常使用的梯度液为常使用的梯度液为4%-20%（W/V）蔗糖蔗糖离心管顶部为离心管顶部为4%的蔗糖，密度的蔗糖，密度1.018 g/mL离心管底部为离心管底部为20%的蔗糖，密度为的蔗糖，密度为1.077 g/mL离心分离方法离心分离方法正确选择正确选择密度梯度的范围密度梯度的范围。对样品的对样品的生物活性生物活性不能有影响。不能有影响。不能影响所使用的测量技术。不能影响所使用的测量技术。注意能否进行高温消毒，对转头是否有影响。注意能否进行高温消毒，对转头是否有影响。梯度材料的选择梯度材料的选择离心分离方法离心分离方法1、虹吸法虹吸法：用一根细：用一根细管插到离心管的底部，管插到离心管的底部，将溶液吸出，用试管将溶液吸出，用试管分部接收，然后进行分部接收，然后进行分析分析。梯度的取出梯度的取出离心分离方法离心分离方法1、顶替法顶替法：把一种很稠的：把一种很稠的介质，如介质，如60-70的蔗糖溶的蔗糖溶液慢慢注入离心管底部，液慢慢注入离心管底部，将离心管中的溶液顶替出将离心管中的溶液顶替出来。来。离心分离方法离心分离方法2、穿刺法穿刺法：将离心管固：将离心管固定在支架上，在离心管定在支架上，在离心管底部贴一块胶布，防止底部贴一块胶布，防止穿刺后液体泄漏。用针穿刺后液体泄漏。用针头仔细穿过塑料离心管头仔细穿过塑料离心管的底部，此时液体顺针的底部，此时液体顺针头缓缓地逐滴流出，可头缓缓地逐滴流出，可用试管按体积分部接收，用试管按体积分部接收，然后进行分析。然后进行分析。离心分离方法离心分离方法4、冷冻切段法：将离心好地试管进行冷冻，再切、冷冻切段法：将离心好地试管进行冷冻，再切成段，将不同的区带分开。成段，将不同的区带分开。离心分离方法离心分离方法3、虹吸法：、虹吸法：用蠕动泵或吸管将样品从上至下逐用蠕动泵或吸管将样品从上至下逐层按区带吸出并分管收集。泵管或吸管注意每区层按区带吸出并分管收集。泵管或吸管注意每区带一管，不能混用。带一管，不能混用。离心机使用注意事项离心机使用注意事项一、不可使用有机溶剂一、不可使用有机溶剂离心机无法预防爆炸情况的离心机无法预防爆炸情况的发生发生！请不要使用有机溶剂离请不要使用有机溶剂离心！心！如在特别的状况下，如在特别的状况下，必须要非常小心，不必须要非常小心，不要要让液体流出让液体流出,并且使并且使用密封式用密封式Rotor！二、转子速度的设定二、转子速度的设定离心机转子标出的最高转速一般是在使用塑料离心管、离心机转子标出的最高转速一般是在使用塑料离心管、样品的平均密度低于样品的平均密度低于1.2g/cm3或者按照说明书的要求低于或者按照说明书的要求低于某一装载量时，才能达到的最高安全使用转速。某一装载量时，才能达到的最高安全使用转速。当离心管、管帽或套管材质更换成大密度材质时，应降当离心管、管帽或套管材质更换成大密度材质时，应降低运转速度（低于最大速度）。低运转速度（低于最大速度）。转头都有一定的使用极限，到一定时限后，最高使用转转头都有一定的使用极限，到一定时限后，最高使用转速必须降低速必须降低10-20%。离心机使用注意事项离心机使用注意事项当离心样品当离心样品平均密度大于平均密度大于1.2克克/立方厘米立方厘米，按下式计算，按下式计算实际最高转速：实际最高转速：1.2NN最大最大实际实际有些转子说明书中给出的是转子的最大装样量，按下式有些转子说明书中给出的是转子的最大装样量，按下式计算实际最高转速：计算实际最高转速：实际重量实际重量最大装载量最大装载量最大最大实际实际NN离心机使用注意事项离心机使用注意事项三、样品的装载和平衡三、样品的装载和平衡由于离心时产生很大的离心力，当转头所由于离心时产生很大的离心力，当转头所带的样品处于不平衡状态时，会产生很大带的样品处于不平衡状态时，会产生很大的力矩。轻者引起的力矩。轻者引起机器发抖和震动机器发抖和震动，重者，重者会会扭断转轴造成事故扭断转轴造成事故。离心机使用注意事项离心机使用注意事项静平衡：静平衡：对称的两管样品对称的两管样品等重。等重。动平衡：离心时产生的力动平衡：离心时产生的力矩不仅与样品的重量有关，矩不仅与样品的重量有关，还和样品的还和样品的旋转半径旋转半径有关。有关。处于对称位置的两个离心处于对称位置的两个离心管必须装载管必须装载密度相近密度相近的样品。的样品。离心机使用注意事项离心机使用注意事项（illustration of correct set）（illustration of incorrect setting）：with tube：without tube放置放置已平衡好的已平衡好的Tube和和Bottls,其放置的位置必須其放置的位置必須为对称为对称两个对称两个对称的的Tube和和Bottls,如右如右图图情形是不情形是不允许的允许的离心机使用注意事项离心机使用注意事项四、四、tube/bottles的放置的放置在在Rotor body上的上的bucket的的孔洞孔洞必須全部裝滿必須全部裝滿,不论不论是否有包含是否有包含样品样品*运转时运转时必須將必須將所有的所有的Buckets都都放入到放入到Rotor body內內,其主要預防在其主要預防在启启动运转时动运转时造成造成Buckets变形变形（illustration of correct set）（illustration of incorrect setting）离心机使用注意事项离心机使用注意事项五、五、清洗及消毒清洗及消毒Rotor1.清洗清洗清洗清洗涂抹涂抹使用水或使用水或中性中性清洁剂清洗，清洁剂清洗，并且需使用去离子水冲洗并且需使用去离子水冲洗 (清洁剂清洁剂:pH 59)pH 59)铝合金铝合金/钛合金钛合金:低于低于100C碳纤维碳纤维:低于低于80C干燥干燥表面表面:Silicone grease 螺纹螺纹部分部分:Aluminum LubricantPacking/O-ring:Vacuum grease离心机使用注意事项离心机使用注意事项2.消毒消毒消毒的方式消毒的方式铝合金铝合金/钛合金钛合金 RotorRotor碳纤维碳纤维 RotorRotor 高压蒸汽高压蒸汽 煮沸消毒煮沸消毒 紫外线消毒紫外线消毒200300200300nm nm Ethylene oxideEthylene oxide环氧环氧乙烷乙烷 气体消毒气体消毒 Formaldehyde Formaldehyde甲醛甲醛 70%70%EthanolEthanol乙醇乙醇 化学药剂化学药剂 3%3%Hydrogen Hydrogen peroxedeperoxede 3%Formalin 3%Formalin福尔马林福尔马林 RotorRotor耐热温度耐热温度 100 100 C C 8080 C C 离心机使用注意事项离心机使用注意事项Tube/Bottles1.清洗清洗 清洗清洗的方式的方式Tube/BottlesTube/Bottles附件附件PA,PEPA,PEPETPETPCPCCap,adapter Cap,adapter ectect.水性洗涤剂水性洗涤剂(pH5)(pH9)pH9)温水温水(50(50 C C)超声波清洁超声波清洁(清洗剂清洗剂 电荷高者电荷高者离子离子大者大者浓度浓度大者大者离子交换层析离子交换层析130What happens in ion exchange?Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+anionexchangerbead-离子交换层析离子交换层析离子交换剂种类离子交换剂种类在在惰性载体惰性载体上引入上引入带有电荷的活性基团带有电荷的活性基团即离子交换剂。即离子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换离子交换层析离子交换层析（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同1 1、离子交换树脂：聚苯乙烯树脂、离子交换树脂：聚苯乙烯树脂聚苯乙烯聚苯乙烯苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯离子交换层析离子交换层析+离子交换层析离子交换层析离子交换树脂的特性离子交换树脂的特性多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂稳定性：稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团2、离子交换纤维素离子交换纤维素阴离子交换纤维素阴离子交换纤维素 如如:DEAE-纤维素，纤维素，pH8.6以以下分离中性或酸性物质，具二乙胺乙基下分离中性或酸性物质，具二乙胺乙基阳离子交换纤维素阳离子交换纤维素如如:CM-纤维素，一般纤维素，一般pH4条件下使用，具有羧甲基条件下使用，具有羧甲基 离子交换层析离子交换层析3、离子交换凝胶离子交换凝胶分离大分子物质分离大分子物质如：如：葡聚糖（葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAG）琼脂糖（琼脂糖（Sepharose）离子交换层析离子交换层析离子交换层析的应用离子交换层析的应用 主要用于分离蛋白质、多肽、氨基主要用于分离蛋白质、多肽、氨基酸，也可用于分离核酸、核苷酸及酸，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。其他带电荷的生物分子。离子交换层析离子交换层析举例：举例：当当pIpH时时，蛋，蛋白质带净正电荷。已知蛋白质白质带净正电荷。已知蛋白质X X等电点为等电点为7，设计实验利用阴，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。离子交换树脂纯化。建立阴离子交换柱，比如建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用。用pH8.5的缓冲液平的缓冲液平衡柱子，同时蛋白衡柱子，同时蛋白X溶解于溶解于pH8.5的缓冲液中，在此的缓冲液中，在此pH值下值下蛋白蛋白X带有负电，将含有蛋白带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析Affinity Chromatography亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术。设计的纯化技术。亲和层析法亲和层析法SpecificBindingSubstance(B)洗脱Elution配 体Ligand(A)耦合反应 Coupling Reaction杂质BBBBSolid MatrixB亲和层析法的四要素：亲和层析法的四要素：固相载体固相载体 亲和配体亲和配体 耦合反应耦合反应 与配体与配体可逆结合可逆结合的生物分子的生物分子亲和层析法的作用机理：亲和层析法的作用机理：亲和层析法亲和层析法混合蛋白样品混合蛋白样品带有配体的树带有配体的树脂珠（或胶粒）脂珠（或胶粒）洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白含配体溶液含配体溶液平衡液平衡液收集目的蛋白收集目的蛋白亲和层析法亲和层析法专一性亲和力的构成因素：专一性亲和力的构成因素：I.Conformational Match:Van der waals interaction+K两分子间因构两分子间因构象象互补所造成的互补所造成的吸引力是由范德瓦尔力所贡献吸引力是由范德瓦尔力所贡献+-=OH-N-II.Interaction Forces:(1)Hydrogen bond (2)Hydrophobic interaction (3)Electrostatic interaction (4)Van der waals interaction亲和层析法亲和层析法Van der Waal interactionsbetween non-polar surfacesConformational Matchn构型互补所造成的吸引力构型互补所造成的吸引力亲和层析法亲和层析法90kcal/mole3kcal/mole1kcal/mole1kcal/mole0.1kcal/mole一个二级键的大约键能一个二级键的大约键能n 二级键：次于共价键的结合能力二级键：次于共价键的结合能力离子键离子键氢氢 键键疏水键疏水键范德瓦尔力范德瓦尔力亲和层析法亲和层析法配体配体亲和性分子亲和性分子说明说明抗体对应的抗原免疫吸附剂，大多自行合成底物或抑制剂对应的酶酶的专一性结合Protein A部分IgG单株抗体纯化Con A刀豆素糖蛋白对 a-D-葡萄糖、甘露糖基有专一性Heparin凝血蛋白等Heparin Sepharose CL-6BOligo(dT)mRNAOligo(dT)-celluloseCibacron-BlueNAD（P）+结合酶Blue Sepharose CL-6BAMP,ADPNAD（P）+结合酶5AMP-,2,5ADP-Sepharose 4B单糖及衍生物Lectin用来纯化 lectin各种亲和性配体及其专一性基团各种亲和性配体及其专一性基团亲和层析法亲和层析法具有良好的物理化学稳定性具有良好的物理化学稳定性载体的选择载体的选择均匀多孔的网状结构，有良好的渗透性均匀多孔的网状结构，有良好的渗透性具备大量能被活化的基团，能和配体稳定结合具备大量能被活化的基团，能和配体稳定结合与样品中的各组分均没有明显的非特异性吸附与样品中的各组分均没有明显的非特异性吸附抗微生物和酶的侵蚀抗微生物和酶的侵蚀亲和层析法亲和层析法种类种类优点优点缺点缺点纤维素纤维素价格低，活性集团价格低，活性集团较多较多非特异性吸附强，稳定性和非特异性吸附强，稳定性和均一性较差均一性较差葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶稳定性好稳定性好孔径较小孔径较小聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶同上同上同上同上琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶非特异性吸附低，非特异性吸附低，稳定性好，孔径均稳定性好，孔径均匀适当，宜于活化匀适当，宜于活化多孔玻璃多孔玻璃机械强度好，化学机械强度好，化学稳定性好稳定性好活性集团较少，对蛋白质有活性集团较少，对蛋白质有较强的吸附作用较强的吸附作用各类载体的优缺点各类载体的优缺点亲和层析法亲和层析法配体的选择配体的选择1与待分离与待分离的物质有的物质有适当的亲适当的亲和力和力2与待分离与待分离物质之间物质之间的亲和力的亲和力要有较强要有较强的特异性的特异性3与载体稳与载体稳定的共价定的共价结合结合4与待分离与待分离的物质有的物质有适当的亲适当的亲和力和力亲和层析法亲和层析法配体的分类配体的分类特异性配体特异性配体 只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体 egeg.抗原和抗体、酶和它的抑制剂抗原和抗体、酶和它的抑制剂通用性配体通用性配体 特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体的配体 egeg.凝集素可以结合各种糖蛋白凝集素可以结合各种糖蛋白亲和层析法亲和层析法洗脱方法洗脱方法特异性洗脱特异性洗脱 利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性亲和特性而而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。非特异性洗脱非特异性洗脱 通过改变通过改变洗脱缓冲液洗脱缓冲液pH、离子强度离子强度、温度温度等条件，降低待等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。亲和层析法亲和层析法特异性洗脱特异性洗脱亲和层析法亲和层析法特异性洗脱的优缺点特异性洗脱的优缺点优点优点缺点缺点改善方法改善方法特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率响，从而得到较高的分辨率可避免蛋白质变性可避免蛋白质变性较长的时间和较大的洗脱条件较长的时间和较大的洗脱条件选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度亲和层析法亲和层析法非特异性洗脱非特异性洗脱待分离物质与配体亲和力较小待分离物质与配体亲和力较小 连续连续大体积平衡缓冲液大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱液体积冲洗，不影响活性，但洗脱液体积较大，待分离物质浓度较低。较大，待分离物质浓度较低。待分离物质与配体结合较强时待分离物质与配体结合较强时 适当的适当的pH、离子强度、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性。的活性。待分离物质与配体集合非常牢固时待分离物质与配体集合非常牢固时 使用较强的使用较强的酸、碱酸、碱或在洗脱液中加入或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂脲、胍等变性剂，使，使蛋白质等带分离物质变性，洗脱后再复性。蛋白质等带分离物质变性，洗脱后再复性。亲和层析法亲和层析法加样加样除去非特异性除去非特异性结合的蛋白质结合的蛋白质基本操作基本操作固定配体固定配体+选择配体选择配体+洗脱纯的洗脱纯的目的蛋白目的蛋白+亲和层析法亲和层析法1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionMatrixSpecific ligandEquilibrate the column and the sample to binding conditions.亲和层析法亲和层析法1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionTarget bindsOthers wash outApply sample under binding conditions.亲和层析法亲和层析法1.Equilibration2.Sample application3.Binding and washing4.Desorption and elutionTarget elutesChange the eluent to elute the target.亲和层析法亲和层析法亲和层析法亲和层析法亲和层析的优点亲和层析的优点只需一步纯化步骤即可只需一步纯化步骤即可使待分离物质从复杂的使待分离物质从复杂的混合物中分离出来。混合物中分离出来。产物纯度很高。产物纯度很高。可从很稀的溶液中纯化可从很稀的溶液中纯化到所需物质。到所需物质。亲和层析的缺点亲和层析的缺点可能吸附一些杂蛋白质。可能吸附一些杂蛋白质。洗脱过程中的配体不可洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体避免的脱落进入分离体系。系。载体较昂贵，配基制备载体较昂贵，配基制备困难。困难。亲和层析的应用亲和层析的应用 目前亲和层析技术被广泛应用在蛋白质研究和制备领域，是目前亲和层析技术被广泛应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。亲和层析法亲和层析法蛋白质研究蛋白质研究和制备领域和制备领域凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白抗原和抗体抗原和抗体激素和受体蛋白激素和受体蛋白含有辅酶的酶类含有辅酶的酶类多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸氨基酸氨基酸生物素和亲和素生物素和亲和素 快速液相蛋白纯化系统快速液相蛋白纯化系统气相色谱仪气相色谱仪液相色谱仪液相色谱仪 1.一个体积为一个体积为100 mL悬浮液中有三种物质悬浮液中有三种物质A、B、C，沉降系数分别为，沉降系数分别为100S、20S、5S。采用差速。采用差速离心的方法分离纯化物质离心的方法分离纯化物质A。2.设定离心转速和平衡样品时有哪些注意事项？设定离心转速和平衡样品时有哪些注意事项？思考题思考题谢谢 谢！谢！