组合生物催化

组合生物催化组合生物催化（Combinatorial Biocatalysis）汇报内容汇报内容：1.组合生物催化的理论基础与特点组合生物催化的理论基础与特点2.组合生物催化的类型组合生物催化的类型3.组合生物催化的关键技术组合生物催化的关键技术4.组合生物催化的实例组合生物催化的实例5.结论与展望结论与展望 理论基础：理论基础：在自然界的生物体内，很多次生代谢物往往是一些小分在自然界的生物体内，很多次生代谢物往往是一些小分子的初级代谢产物经过由不同的酶参与的代谢途径而转子的初级代谢产物经过由不同的酶参与的代谢途径而转化生成。例如，生物碱就是初级代谢产物氨基酸通过生化生成。例如，生物碱就是初级代谢产物氨基酸通过生物合成途径产生的。受这种现象的启发，一种新的合成物合成途径产生的。受这种现象的启发，一种新的合成方法逐渐发展完善起来，这就是组合生物催化。只不过方法逐渐发展完善起来，这就是组合生物催化。只不过生物合成途径是在生物体内完成的，而组合生物催化是生物合成途径是在生物体内完成的，而组合生物催化是在体外完成的。在体外完成的。一、组合生物催化的理论基础和特点一、组合生物催化的理论基础和特点 所谓组合生物催化，就是系统地利用生物催化技术对天所谓组合生物催化，就是系统地利用生物催化技术对天然产物或合成化合物进行修饰，从而建立起高质量的化然产物或合成化合物进行修饰，从而建立起高质量的化合物文库，希望能从这些文库中筛选出活性更高或性能合物文库，希望能从这些文库中筛选出活性更高或性能更佳的新化合物。更佳的新化合物。组合生物催化的核心是生物催化，组合生物催化的核心是生物催化，“组合组合”不过是一种不过是一种合成的策略。合成的策略。组合生物催化和组合化学的关系组合生物催化和组合化学的关系：联系联系：组合生物催化是酶催化、化学催化和微生物转组合生物催化是酶催化、化学催化和微生物转化在组合化学中的应用，即通过对先导化合物的转化化在组合化学中的应用，即通过对先导化合物的转化产生库。两者都是以建立化合物文库为目的。产生库。两者都是以建立化合物文库为目的。区别区别：在原理和方法上都有明显的区别，组合化学主：在原理和方法上都有明显的区别，组合化学主要通过某种反应进行合成，常常有多种化合物参与反要通过某种反应进行合成，常常有多种化合物参与反应，而组合生物催化主要通过多种生物催化方法对某应，而组合生物催化主要通过多种生物催化方法对某种化合物进行衍生，通常情况下先导化合物只有一个。种化合物进行衍生，通常情况下先导化合物只有一个。在自然模式下，创造新的有机分子所需时间太长，不适宜于药物发现的研究。在自然模式下，创造新的有机分子所需时间太长，不适宜于药物发现的研究。组合生物催化就是要加速这个自然模式，且将其运用于发现并优化医药和农组合生物催化就是要加速这个自然模式，且将其运用于发现并优化医药和农业化合物中。如图业化合物中。如图1b所示，这种方法能够利用天然催化剂所示，这种方法能够利用天然催化剂(酶或完整细胞酶或完整细胞)丰丰富的多样性，以及一些生长迅速的重组的和工程酶，对一些有希望的药物和富的多样性，以及一些生长迅速的重组的和工程酶，对一些有希望的药物和农用化合物的先导物直接进行衍生化农用化合物的先导物直接进行衍生化(注意区分组合生物催化和组合物合成，注意区分组合生物催化和组合物合成，后者是指在活的微生物中，通过生物合成途径的基因工程方法，从天然产物后者是指在活的微生物中，通过生物合成途径的基因工程方法，从天然产物产生新的分子产生新的分子)。图图1 组合生物合成新的生物分子的途径组合生物合成新的生物分子的途径 (a)从从自然界自然界的合成子的合成子;(b)从从细胞外细胞外的先导化合物的先导化合物组合生物催化的特点：组合生物催化的特点：广泛的反应可能性广泛的反应可能性;高区域选择性和立体选择性高区域选择性和立体选择性,能进行位控修饰能进行位控修饰;单步反应单步反应,避免了保护和脱保护步骤避免了保护和脱保护步骤;自动方便自动方便,在温和均匀的条件下在温和均匀的条件下,反复进行单步反应反复进行单步反应;反应条件温和反应条件温和,适宜于复杂、适宜于复杂、不稳定的分子不稳定的分子;活性高活性高,这样催化剂的浓度低这样催化剂的浓度低;酶催化剂固定化后可以循环利用酶催化剂固定化后可以循环利用;酶能被环境完全降解酶能被环境完全降解;组合生物催化的优势主要是通过生物催化剂组合生物催化的优势主要是通过生物催化剂酶反应的特点来酶反应的特点来体现。酶的最大优点在于它具有体现。酶的最大优点在于它具有高度的选择性高度的选择性，这样既可以免，这样既可以免去在对某些多官能团先导化合物修饰中繁琐的基团保护和去基去在对某些多官能团先导化合物修饰中繁琐的基团保护和去基团保护，又可以保护先导化合物的手性特征不至于被破坏，适团保护，又可以保护先导化合物的手性特征不至于被破坏，适合一般都要求一定的立体结构，而酶法修饰正好可以满足这方合一般都要求一定的立体结构，而酶法修饰正好可以满足这方面的需求；另外酶反应还具有效率高、收率高和副产物少的优面的需求；另外酶反应还具有效率高、收率高和副产物少的优点。相比剧烈的化学反应，温和的酶反应条件对于那些热敏感点。相比剧烈的化学反应，温和的酶反应条件对于那些热敏感的先导化合物的合成也有很大的优势。的先导化合物的合成也有很大的优势。图图2.先导化合物可能进行的生物催化转化先导化合物可能进行的生物催化转化 (L 代表先导核心代表先导核心)所示的这些途径所有可能反应的一部分所示的这些途径所有可能反应的一部分,其目的为了说明仅由生其目的为了说明仅由生物催化所产生的一些衍生物物催化所产生的一些衍生物 (注注:X=CI,Br 或或 I;Vin=乙烯基乙烯基)组合生物催化中常见的反应类型：组合生物催化中常见的反应类型：二、组合生物催化的类型二、组合生物催化的类型 在组合合成平台使用生物催化剂的一个最大障碍是欲修饰的很多底在组合合成平台使用生物催化剂的一个最大障碍是欲修饰的很多底物难溶于水，而大多数酶体系的微环境是水，这些酶在有机溶剂中物难溶于水，而大多数酶体系的微环境是水，这些酶在有机溶剂中的催化活性大大降低，因此能够使酶在水环境中发挥合成功效的方的催化活性大大降低，因此能够使酶在水环境中发挥合成功效的方法常常使得反应在有机溶剂中无法进行。利用非水介质可以显著地法常常使得反应在有机溶剂中无法进行。利用非水介质可以显著地扩大酶的体外反应的范围。虽然酶在有机溶剂中可以保持其活性，扩大酶的体外反应的范围。虽然酶在有机溶剂中可以保持其活性，但是其催化效率通常比水中要低几个数量级。但近来的研究表明，但是其催化效率通常比水中要低几个数量级。但近来的研究表明，适当地控制酶的微环境可以大大提高酶在有机溶剂中的活力。适当地控制酶的微环境可以大大提高酶在有机溶剂中的活力。1.非水介质中的生物催化非水介质中的生物催化 酶活化技术：酶活化技术：1.盐活化法盐活化法 例子：在正已烷中，非缓冲盐对枯草溶菌素催化的例子：在正已烷中，非缓冲盐对枯草溶菌素催化的N-乙酰基乙酰基-L-苯丙苯丙氨酸乙酯和正丙醇的转酯化反应的影响。具体如下：制备含氨酸乙酯和正丙醇的转酯化反应的影响。具体如下：制备含98%盐盐的生物催化剂时，将酶和的生物催化剂时，将酶和KCI一起冷冻干燥，使得枯草溶菌素的催化一起冷冻干燥，使得枯草溶菌素的催化性质性质Kcat/Km提高了提高了3 700倍以上。该技术已被延用到非丝氨酸蛋白倍以上。该技术已被延用到非丝氨酸蛋白酶酶(包括嗜热菌蛋白酶包括嗜热菌蛋白酶),取得了类似的活化性质。例如取得了类似的活化性质。例如,盐活化的嗜热盐活化的嗜热菌蛋白酶已被用于紫杉醇菌蛋白酶已被用于紫杉醇2p-酯基衍生物的合成。与天然的嗜热菌蛋酯基衍生物的合成。与天然的嗜热菌蛋白酶相比，紫杉醇在叔戊醇中的酰化活力提高了白酶相比，紫杉醇在叔戊醇中的酰化活力提高了20倍。盐活化的枯倍。盐活化的枯草溶菌素也被用于选择性的酰化矮茶素、腺苷、草溶菌素也被用于选择性的酰化矮茶素、腺苷、3-羟基托烷和双环羟基托烷和双环2.2.2 辛辛-5-烯烯 2,3-二甲醇。这样，盐活化法代表了一种活化二甲醇。这样，盐活化法代表了一种活化酶的普遍技术酶的普遍技术,它使复杂分子能在有机介质中利用酶的催化特性进行它使复杂分子能在有机介质中利用酶的催化特性进行酰化。酰化。2.表面活性剂表面活性剂 即指利用低浓度的表面活性剂将酶溶解。虽然酶在几乎所有的有即指利用低浓度的表面活性剂将酶溶解。虽然酶在几乎所有的有机溶剂中都不溶解机溶剂中都不溶解(但是具有一定的活力但是具有一定的活力)，表面活性剂的存在会，表面活性剂的存在会形成疏水性的离子对，这样使酶溶解在疏水性的溶剂中。与悬浮形成疏水性的离子对，这样使酶溶解在疏水性的溶剂中。与悬浮的天然酶相比的天然酶相比,枯草溶菌素在辛烷中的催化活性被提高了四个数枯草溶菌素在辛烷中的催化活性被提高了四个数量级。离子配对的酶在有机溶剂中的溶解性对组合生物催化应用量级。离子配对的酶在有机溶剂中的溶解性对组合生物催化应用于对连接在固相上的底物进行转化反应将特别有用。于对连接在固相上的底物进行转化反应将特别有用。酶反应和生物催化的诸多特性，使得组合生物催化可以运用到有酶反应和生物催化的诸多特性，使得组合生物催化可以运用到有机小分子以及那些用传统的组合技术不容易进行改变的比较复杂机小分子以及那些用传统的组合技术不容易进行改变的比较复杂的天然产物上。图的天然产物上。图3所示的许多先导分子，包括核苷所示的许多先导分子，包括核苷(如腺苷如腺苷)、类黄酮类黄酮(如矮茶素如矮茶素)、生物碱、生物碱(如如 3,6-二羟基托烷二羟基托烷)、聚酮化合物、聚酮化合物Polyketides(如红霉素如红霉素)及萜类和及萜类和Taxane(如紫杉醇如紫杉醇)，被用于那，被用于那些利用组合生物催化进行药物发现和优化的库的生成。这些多样些利用组合生物催化进行药物发现和优化的库的生成。这些多样的结构例证了如何利用组合生物催化产生新的库。的结构例证了如何利用组合生物催化产生新的库。图图3.几个已在组合生物催化中用于库生成的先导分子的例子几个已在组合生物催化中用于库生成的先导分子的例子 酶作为组合生物合成的脱保护工具，使得基团特异的选择性能酶作为组合生物合成的脱保护工具，使得基团特异的选择性能够在温和的条件下进行，也使其能够应用于最脆弱的分子。复够在温和的条件下进行，也使其能够应用于最脆弱的分子。复合脂肪多肽的多步合成中生物催化脱保护的这些优势得到体现，合脂肪多肽的多步合成中生物催化脱保护的这些优势得到体现，青霉素酰化酶应用于高度标记的青霉素酰化酶应用于高度标记的S-软脂酰化的寡肽的选择性软脂酰化的寡肽的选择性N-脱保护，如图脱保护，如图4所示，随后进行的是酶催化除去所示，随后进行的是酶催化除去4-（苯基丙酮）（苯基丙酮）苄氧基羰基保护基团，苄氧基羰基保护基团，S-软脂酰化的寡肽作为进一步合成步骤软脂酰化的寡肽作为进一步合成步骤的构建单元，包括偶联另一个单独固相合成的寡肽连相似的酶的构建单元，包括偶联另一个单独固相合成的寡肽连相似的酶脱保护策略成功应用于酸标记和碱标记的核酸多肽的制备。脱保护策略成功应用于酸标记和碱标记的核酸多肽的制备。2.酶作为组合生物合成的脱保护工具酶作为组合生物合成的脱保护工具图图4.青霉素乙酰化酶从脂蛋白保护基团上脱青霉素乙酰化酶从脂蛋白保护基团上脱 除酶标基因除酶标基因 在固相表面进行的组合合成反应是建立具有丰富差异性的化合在固相表面进行的组合合成反应是建立具有丰富差异性的化合物库所用的最有效的方法之一，多聚体物库所用的最有效的方法之一，多聚体-支持物合成后通过使支持物合成后通过使支持物与合成的化合物之间的连接基团断裂的方法而将得到的支持物与合成的化合物之间的连接基团断裂的方法而将得到的库释放到溶液中去。在过去的几年中，许多具有酶稳定性的连库释放到溶液中去。在过去的几年中，许多具有酶稳定性的连接子研制成功，从而为把化合物自支持物上释放出来提供了一接子研制成功，从而为把化合物自支持物上释放出来提供了一种可选的方案。根据最近的分类方法，酶稳定性的连接子可被种可选的方案。根据最近的分类方法，酶稳定性的连接子可被分成两类，即外连接子和内连接子。如图分成两类，即外连接子和内连接子。如图5、6所示。所示。3.固定化酶催化固定化酶催化 两类连接子都包括一个标记基因，它能使靶健被酶两类连接子都包括一个标记基因，它能使靶健被酶所识别，但是它们的不同之处在于健实际断裂的的所识别，但是它们的不同之处在于健实际断裂的的方式不同。方式不同。内连接形成的健被酶直接识别为作用的内连接形成的健被酶直接识别为作用的靶点，而外连接的健则通过生成中间体再由中间体靶点，而外连接的健则通过生成中间体再由中间体自发碎裂而释放目的化合物。自发碎裂而释放目的化合物。内、外连接的化学反内、外连接的化学反应式见图应式见图5、6。在经过标准的固相肽合成反应后，肽类内连接子被枯燥杆菌蛋在经过标准的固相肽合成反应后，肽类内连接子被枯燥杆菌蛋白酶白酶BPN所断裂而释放出目标肽段。在另一个报道中，合成于所断裂而释放出目标肽段。在另一个报道中，合成于可溶性的多聚支持物表面的低聚糖在胰凝乳蛋白酶的作用下，可溶性的多聚支持物表面的低聚糖在胰凝乳蛋白酶的作用下，被释放到溶液中，酶的作用位点是内连接子上的苯丙氨基酸残被释放到溶液中，酶的作用位点是内连接子上的苯丙氨基酸残基标记基团。基于外连接子的合成策略已经被证实是一些能被基标记基团。基于外连接子的合成策略已经被证实是一些能被青霉素酰基转移酶、脂肪酶作用的小分子。虽然酶法裂解已经青霉素酰基转移酶、脂肪酶作用的小分子。虽然酶法裂解已经被成功应用于可溶性及不可溶性的多聚体支持物，但是由于相被成功应用于可溶性及不可溶性的多聚体支持物，但是由于相对大的酶分子难以进入聚合物串珠样结构的内部而使得合成的对大的酶分子难以进入聚合物串珠样结构的内部而使得合成的化合物不能完全释放，酶在固相载体上的应用仍受到限制。化合物不能完全释放，酶在固相载体上的应用仍受到限制。图图5.从高分子支持物上酶切内连接子释放合成的化合物从高分子支持物上酶切内连接子释放合成的化合物图图6.从高分子支持物上酶切外连接子释放合成的化合物从高分子支持物上酶切外连接子释放合成的化合物 酶能够在组合生物催化领域得到成功应用和进展酶能够在组合生物催化领域得到成功应用和进展的关键在于大量具有广谱底物特异性的酶的有效的关键在于大量具有广谱底物特异性的酶的有效性。最近在新酶发现发面的进展得益于重组性。最近在新酶发现发面的进展得益于重组DNA技术，它提供了大量的机会得以获得更多组合生技术，它提供了大量的机会得以获得更多组合生物催化所需的工具酶，从而为产生大量理想化合物催化所需的工具酶，从而为产生大量理想化合物库提供了条件。物库提供了条件。三、关键技术三、关键技术1.微生物技术和酶技术微生物技术和酶技术 组合生物催化的核心技术就是生物催化。生物催化是指利用组合生物催化的核心技术就是生物催化。生物催化是指利用生物体系或其产生的酶体系对外源性化合物进行结构修饰的生物生物体系或其产生的酶体系对外源性化合物进行结构修饰的生物化学过程。用于组合生物催化的生物体系最多的一种是微生物体化学过程。用于组合生物催化的生物体系最多的一种是微生物体系，包括微生物的采集、分离、培养、鉴定、保存等关键技术。系，包括微生物的采集、分离、培养、鉴定、保存等关键技术。由于有些催化反应要在非水介质中进行，而微生物又难于在由于有些催化反应要在非水介质中进行，而微生物又难于在其中生长，所以对于这些反应需用纯化的酶进行催化。酶的来源：其中生长，所以对于这些反应需用纯化的酶进行催化。酶的来源：1.购买；购买；2.发酵，分离纯化。为了提高酶在非水介质中的活力，发酵，分离纯化。为了提高酶在非水介质中的活力，需要对酶进行固定化处理。需要对酶进行固定化处理。2.化合物的快速分析鉴定化合物的快速分析鉴定 由于组合生物催化的目的在于建立化合物文库，所以产物数量较由于组合生物催化的目的在于建立化合物文库，所以产物数量较大，常规的分析鉴定方法不能满足需要。在组合生物催化中使用大，常规的分析鉴定方法不能满足需要。在组合生物催化中使用的快速分析鉴定方法有高通量质谱分析（一个样品的快速分析鉴定方法有高通量质谱分析（一个样品/min）、用于）、用于在线鉴定的高效液相色谱在线鉴定的高效液相色谱-质谱联用技术等。另外，新的分析鉴质谱联用技术等。另外，新的分析鉴定技术的开发和应用，如液相色谱定技术的开发和应用，如液相色谱核磁共振联用技术必然会促核磁共振联用技术必然会促进组合生物催化的发展。当然，要根据产物的结构不同来选择具进组合生物催化的发展。当然，要根据产物的结构不同来选择具体的方法。体的方法。3.高通量药物筛选高通量药物筛选高通量筛选高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。运转的技术体系。四、组合生物催化实例四、组合生物催化实例 Adamczyk等人曾报道等人曾报道,利用脂酶利用脂酶(特别是洋葱假单胞菌特别是洋葱假单胞菌Pseudomonas cepacia 脂酶脂酶)来产生一个酰胺库。以芳香二酯，二苄基来产生一个酰胺库。以芳香二酯，二苄基-1,2-苯二苯二氧二醋酸酯为核心物氧二醋酸酯为核心物,以单以单-(N-叔丁氧羰基叔丁氧羰基)二胺作为二酯的反应伴二胺作为二酯的反应伴体。该二酯和五个单体。该二酯和五个单-(N-叔丁氧羰基叔丁氧羰基)二胺的混合物反应生产一个二胺的混合物反应生产一个26个不同产物的库个不同产物的库,包括包括15个双酰胺个双酰胺,5个单酰胺单酯和五种较少量的个单酰胺单酯和五种较少量的单酸产物。此例说明洋葱假单胞菌单酸产物。此例说明洋葱假单胞菌Pseudomonas cepa2cia 脂酶具脂酶具有将苄酯转变成酰胺的广泛的专一性有将苄酯转变成酰胺的广泛的专一性,这样完成了一个双酰胺库的组这样完成了一个双酰胺库的组合合成。合合成。1.从聚苄酯获得酰胺库从聚苄酯获得酰胺库2.自动合成矮茶素库自动合成矮茶素库 运用广泛的生物催化反应对类黄酮矮茶素进行衍生化，运用广泛的生物催化反应对类黄酮矮茶素进行衍生化，可以自动、可以自动、反复地合成得到一个含反复地合成得到一个含 600 个衍生物的库。个衍生物的库。利用一种多探头液控自动仪在利用一种多探头液控自动仪在 96-槽平板中对候选生槽平板中对候选生物催化剂进行初始筛选物催化剂进行初始筛选,发现有发现有 16个纯化的酶和个纯化的酶和25个个微生物能够接受矮茶素为底物。利用这些酶来改变矮微生物能够接受矮茶素为底物。利用这些酶来改变矮茶素，所得的衍生物即产生了一个多样化的库茶素，所得的衍生物即产生了一个多样化的库(图图4)。图图7.通过组合生物催化自动生成矮茶素衍生物的过程通过组合生物催化自动生成矮茶素衍生物的过程 可对矮茶素进行的反应包括可对矮茶素进行的反应包括:在该先导分子中引入新的官能团在该先导分子中引入新的官能团(如如羟化和卤化羟化和卤化),改变现有的官能团改变现有的官能团(如氧化和还原如氧化和还原),以及在现有的以及在现有的官能团上增加新的基团官能团上增加新的基团(如酰化、糖基化和磷酸化如酰化、糖基化和磷酸化)等等。反应中等等。反应中生成的每种衍生物可用高通量质谱或先选择性地衍生化后再用生成的每种衍生物可用高通量质谱或先选择性地衍生化后再用13C核磁共振谱进行证实。所产生的库可以针对包括黄嘌呤氧化核磁共振谱进行证实。所产生的库可以针对包括黄嘌呤氧化酶酶(治疗痛风和多种硬化症的潜在标耙治疗痛风和多种硬化症的潜在标耙)和尿激酶和尿激酶(一种抗癌标耙一种抗癌标耙)在内的某些标耙进行生物活性筛选。在起初的筛选中，发现了在内的某些标耙进行生物活性筛选。在起初的筛选中，发现了对这些标耙的抑制作用比矮茶素高两个数量级的新的抑制剂对这些标耙的抑制作用比矮茶素高两个数量级的新的抑制剂，然后又对其最有效的衍生物进行再合成和确证。然后又对其最有效的衍生物进行再合成和确证。3.医药化合物的生物催化合成医药化合物的生物催化合成 肽的环化作用肽的环化作用：几乎所有的非核糖体多肽合成酶（几乎所有的非核糖体多肽合成酶（NRPS）都具有环化作用，）都具有环化作用，这是终端硫酯酶这是终端硫酯酶(TE)结构域起作用的，线性肽的区域选择环结构域起作用的，线性肽的区域选择环化是那些具有药用作用的化合物必不可少的，但是很难通过化是那些具有药用作用的化合物必不可少的，但是很难通过化学方法来合成。随着多种化学方法来合成。随着多种TE结构域的发现及其作用机理的结构域的发现及其作用机理的研究，发现可以利用带有研究，发现可以利用带有TE结构域的结构域的NRPS通过生物合成途通过生物合成途径大量生产环肽，或利用某些分离出来的径大量生产环肽，或利用某些分离出来的TE结构域对化学合结构域对化学合成的多肽底物进行环化，以获得所需的环肽。因此，终端硫成的多肽底物进行环化，以获得所需的环肽。因此，终端硫酯酶酯酶(TE)已经被作为一个独立的具有环化作用的生物催化剂。已经被作为一个独立的具有环化作用的生物催化剂。许多环形肽利用许多环形肽利用NRPS已经从固相多肽合成中得到。已经从固相多肽合成中得到。Figure 8.Standalone Tyc TE domain catalyzes the chemoenzymatic synthesis of cyclic peptides from the linear precursors.先在先在PEGA树脂上固相合成树脂上固相合成 300多种线性短杆菌酪肽抗生素多种线性短杆菌酪肽抗生素的衍生物，然后将这些含有线性肽的树脂与重组表达的的衍生物，然后将这些含有线性肽的树脂与重组表达的TycTE蛋白（环化酶）一起温育，通过环化酶在树脂上催化蛋白（环化酶）一起温育，通过环化酶在树脂上催化的环化反应，高效地释放出环肽，从而建立了短杆菌酪肽的的环化反应，高效地释放出环肽，从而建立了短杆菌酪肽的环肽文库。他们从环肽文库中筛选到对细菌细胞膜的选择性环肽文库。他们从环肽文库中筛选到对细菌细胞膜的选择性提高提高30倍的短杆菌酪肽的环肽，该环肽的价值在于能大大降倍的短杆菌酪肽的环肽，该环肽的价值在于能大大降低短杆菌酪肽引起的溶血副作用。最后他们根据该环肽的结低短杆菌酪肽引起的溶血副作用。最后他们根据该环肽的结构，构建基因工程的构，构建基因工程的NRPS，通过发酵来大规模生产该环肽。，通过发酵来大规模生产该环肽。酰基化作用：酰基化作用：酰基转移酶是一类合成天然产物重要酶类之一，具有底物特酰基转移酶是一类合成天然产物重要酶类之一，具有底物特异性，它在合成紫杉醇、柔红霉素、洛伐他汀中具有选择性异性，它在合成紫杉醇、柔红霉素、洛伐他汀中具有选择性催化作用。辛伐他汀是一种重要的降低血液中的胆固醇含量催化作用。辛伐他汀是一种重要的降低血液中的胆固醇含量的药物。辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物（图的药物。辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物（图9），而洛），而洛伐他汀可由土曲霉代谢产物分离获得。传统的辛伐他汀生产伐他汀可由土曲霉代谢产物分离获得。传统的辛伐他汀生产工艺是以洛伐他汀为原料，经化学合成得到。随着现代生物工艺是以洛伐他汀为原料，经化学合成得到。随着现代生物学的发展，学的发展，辛伐他汀的生物合成受到越来越多的重视。辛伐他汀的生物合成受到越来越多的重视。Figure 9.LovD catalyzes the synthesis of simvastatin acid from monacolin J acid and the acyl donor DMB-SMMP 糖基化作用糖基化作用：许多重要的天然产物通过糖基转移酶而得到修饰，糖许多重要的天然产物通过糖基转移酶而得到修饰，糖基化修饰对那些天然产物的活性是非常重要的，包括基化修饰对那些天然产物的活性是非常重要的，包括抗生素、红霉素、万古霉素、柔红霉素以及抗癌化合抗生素、红霉素、万古霉素、柔红霉素以及抗癌化合物正定霉素、光神霉素；糖基化修饰可以提高或改变物正定霉素、光神霉素；糖基化修饰可以提高或改变原来化合物的活性。糖基化作用是一个很有前途的发原来化合物的活性。糖基化作用是一个很有前途的发现新药的平台。近几年来，一些现新药的平台。近几年来，一些GTS（糖基转移酶）（糖基转移酶）已经作为生物催化剂应用于合成天然产物。已经作为生物催化剂应用于合成天然产物。五、结论和展望五、结论和展望 药物发现是一项高风险高投入的工作，传统的方法是从大量药物发现是一项高风险高投入的工作，传统的方法是从大量的化学资源中筛选出有望成为新药的先导化合物（可能的资的化学资源中筛选出有望成为新药的先导化合物（可能的资源包括机体内存在的化学库、发酵液、植物抽提物等），然源包括机体内存在的化学库、发酵液、植物抽提物等），然后进行化学修饰后进行化学修饰,虽然起初的先导结构被修饰并药理活性得虽然起初的先导结构被修饰并药理活性得到了很大提高（期望的性质包括到了很大提高（期望的性质包括:增加效率、提高选择性、增加效率、提高选择性、降低毒性和具有更大的生物利用率）。但是其成功的可能性降低毒性和具有更大的生物利用率）。但是其成功的可能性很低很低,潜在的花费很高。普遍的观点是潜在的花费很高。普遍的观点是:10,000 个化合物仅个化合物仅有一个可能成为新的药物有一个可能成为新的药物,从发现到上市总共需要从发现到上市总共需要 12 年的时年的时间间,要花费约要花费约3.5亿美元。亿美元。相比传统的方法，组合化学具有从根本上改变新药发现途径相比传统的方法，组合化学具有从根本上改变新药发现途径的潜力。其总体目标就是更快更廉价并且极大量地制造新分的潜力。其总体目标就是更快更廉价并且极大量地制造新分子以便进行高通量筛选。这一方法又有不同的形式子以便进行高通量筛选。这一方法又有不同的形式,但大多但大多数都是采用自动合成技术以便集结某一特定的化学砌块数都是采用自动合成技术以便集结某一特定的化学砌块(如如氨基酸、核苷、糖和简单的有机环类等氨基酸、核苷、糖和简单的有机环类等)的所有可能组合的所有可能组合,然然后对组合库进行筛选和归类后对组合库进行筛选和归类,以便能够分离鉴定出所有有活以便能够分离鉴定出所有有活性的产物。组合方法大大地提高了筛选通量性的产物。组合方法大大地提高了筛选通量:一种典型的估一种典型的估计是计是,一位化学家一个月可以合成近一位化学家一个月可以合成近3,300个化合物个化合物,而每个而每个化合物只需花费化合物只需花费12美元。组合化学造就了许多新的药物发现美元。组合化学造就了许多新的药物发现公司公司,同时在几乎所有的大药物公司内得以发展。同时在几乎所有的大药物公司内得以发展。但是，从有希望的先导物发展成为有用的药物需经从对分但是，从有希望的先导物发展成为有用的药物需经从对分子的关键结构特征的重组到不对称中心的重构等大量的优子的关键结构特征的重组到不对称中心的重构等大量的优化工作。生物催化特别适宜于这些工作，而且随着先导化化工作。生物催化特别适宜于这些工作，而且随着先导化合物的结构复杂性的增加，生物催化的优点也会随之变得合物的结构复杂性的增加，生物催化的优点也会随之变得更加重要；特别是在药物发现中代表着先导物丰富源泉的更加重要；特别是在药物发现中代表着先导物丰富源泉的天然产物，由于其通常复杂的结构，生物催化显得尤为重天然产物，由于其通常复杂的结构，生物催化显得尤为重要。新的天然资源的发现和组合合成能力的扩大将确保新要。新的天然资源的发现和组合合成能力的扩大将确保新的先导化合物不断增加，组合生物催化及其在药物发现中的先导化合物不断增加，组合生物催化及其在药物发现中的作用也将自然的随之前进。的作用也将自然的随之前进。