人类生殖与健康学

人类生殖与健康学动医 12-2付湘云2011208223哺乳动物精卵相互作用的分子机制的研究进展付湘云 塔里木大学动物科学学院动医12-2 班 阿拉尔 843300摘要 ： 哺乳动物受精是由一系列有序步骤组成的复杂细胞 相互作用过程组成，最终导致精卵质膜融合形成受精卵。 近来运用基因组学和蛋白质组学技术在哺乳动物精子和卵子表 面鉴定出若干可能参与精卵质膜粘附与融合过程的蛋白分子，并时其 结构和生物学功能进行了研究，但精卵识别与融合的分子机理仍然不 清楚。综述了与精卵识别和融合有关的蛋白的最新研究进展，为进一 步研究精卵相互作用的分子机制提供参考。关键词： 精子卵子受精精卵融合综述及展望哺乳动物包括人类在精子与卵子受精之际，精子均发生生理、生化及 形态上的变化。在此之前首先需要完成的是与精子的成熟及与精浆相 关的精子运动能力的完善。精子进入女性生殖道内，开始时，一般形 态似乎变化不大，而卵细胞则停留在第二次减数分裂中期的状态，等 待排卵。在受精前后精子的变化较为明显要完成获能、顶体反应等功 能性改变。最近的研究观察到一些精子改变的细微表现，但其本质的 原因仍不十分清楚。本文概述精子的变化及其影响因素，可望进一步 探讨其机理，有益于生殖医学及辅助人工受孕(ART)的发展。哺乳动 物受精是一系列有序而复杂的过程组成，包括精子在雌性生殖道中获 能、到达卵母细胞一卵丘复合体、穿透滤泡细胞层、识别透明带、触 发精子的顶体外膜与覆盖其上的精子细胞膜融合而发生顶体放出顶 体酶类、在这些酶类帮助下精子穿透透明带到达卵周隙、精子与卵细 胞膜上面的微绒毛区域结合开始质膜融合。虽然精卵结合和融合是受 精的关键过程，经历了数十年的研究，也取得了一些实质性的进展， 但对其分子基础仍然知之甚少。从精子与透明带相互识别和精子与卵 子质膜相结合与融合两个方面综述了目前所了解的精卵相互作的分 子机制1 精子与透明带的相互作用11 与精子相互作用的透明带中的分子透明带是哺乳动物的精子在受精过程中遇到的第一道屏障，它是 一层由生长的卵母细胞或者卵母细胞与其周围的颗粒细胞共同分泌 （根据种属不同）的疏松的细胞外基质。小鼠的透明带包含3 种主要硫 化糖蛋白，分别是ZP1、ZP2和ZP3。人类的透明带除zPl、zP2和 ZP3夕卜，还有一种在小鼠中不具备功能的ZP4/BT。作为透明带结 构和功能的主要成分，zP2和ZP3在精卵相互作用的一系列反应中具 有特殊的功能。小鼠的zP3既是一个精子受体，优先结合于覆盖在完 整顶体上的精子质膜区域，也是一个受精过程中的顶体反应诱导物； zP3基因的外显子7所编码的多肽羧基端附近的区域是与精子结合的 位点pl。zP3糖蛋白的羧基端附近的0联碳水化合物部分在精子与 透明带相互作用的初期具有重要的作用” 1。zP2能够与发生过顶体 反应的精子顶体内膜结合并且使正在穿越的精子与透明带基质更加 紧密地结合”1。透明带还有保证配子相互作用过程中的物种特异性 以及与受精作用所释放的皮质颗粒酶相互作用，防止多精入卵并且保 护着床前的胚的发育的功能12 与透明带相互作用的精子受体分子由于精子与透明带相互作用的复杂性，很难鉴定出精子表面上介 导最初识别和粘连的对应分子的特征。目前鉴定出的几个可能的透明 带受体上都有识别特殊糖残基的凝集素样的亲和力 1，如小鼠精子 的B. 1, 4.半乳糖基转移酶、sp56、d甘露糖苷酶和透明带外源 凝集素，这与上述精卵相互作用是被ZP3上的碳水化合物的结构引发 的观点相符。然而，进一步的试验证据湿示这些候选分子都不能单独 介导精子和透明带的相互作用，提示最终起作用的可能是几个精子表 面蛋白相互配合形成的多分子复合物，它们中的每一个分子在识别过 程的不同阶段起到特殊的作用。2 精子与卵膜相互作用21 与卵膜相互作用的精子表面蛋白211 ADAM 包含去整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白质家 族(a disinte 鲥 n and metalloproteinase, ADAM)拥有近 40 个成员，它 们中一半是睾丸特异性或睾丸富集性表达，有些仅在睾丸中表达，有 些仅在雄性生殖细胞中表达。睾丸的 ADAM 蛋白经历一些蛋白酶水 解加工过程，在精子表面只留下去整合素结构域、半胱氨酸富含区和 EGF(表皮生长因子)重复区。经过分析其结构域，人们认为它们在受 精过程中可能起重要作用口 o。ADAM蛋白家族是一个整体，它们的 表达是相互依赖的，对雄性生殖细胞中表达的四种ADAM蛋白 （ADAMla、ADAMlb、ADAM2和ADAM3）都已经进行了基因敲除研 究，发现敲除某些ADAM蛋白后会导致雄性不育，但其不育的原因 是因为多种精卵相互作用的缺陷。如精子穿过壶腹部进入输卵管的能 力降低、与透明带的结合能力减弱以及或与卵细胞质膜的结合与融 合能力降低。另外发现，ADAM蛋白在睾丸组织中和精子表面表达 具有相互依存，通过基因敲除而丧失一种ADAM蛋白会影响其它一 种或几种ADAM蛋白的表达。ADAM2和ADAM3都与同一个包 含整合素（1的蛋白质复合体结合一 1。这表明4种ADAM蛋白共同 参与精卵识别，但没有一种是精卵膜融合所必需的。2. 1. 2 CRISP CRISP蛋白家族成员间的序列同源性为30% 80%，并且都在C末端包含一个冨含半胱氨酸的序列，因此称为冨 含半胱氨酸的分泌蛋白（cysteine-rich secretory pmtein, CRISP）。CRISP l被称为DE，以雄性激素依赖的方式在附睾中表达。免疫荧光检测 发现 CRISP. 1 定位于鼠附睾末端精子的顶体背侧区域，在获能或发 生顶体反应后定位于精子赤道段，此处恰好是精子与卵子开始质膜融 合的部位。在马、恒河猴以及人射精后的离体精子上，该蛋白位于精 子尾部主段和中段以及精子头后部区域。CRISP-2即Tpxl，主 要在睾丸中表达;cRISP 一 4仅在附睾中以雄激素依赖的方式表达-o， 而CRIsP-3表现出多组织特异性分布m1。纯化的重组DE和天然DE 蛋白均可与去透明带的卵细胞结合，并抑制精卵融合，且与DE分子 的二硫键有关IIIo。后来利用合成肽以及其它的cRIsPs研究发现，DE 与卵膜的结合部位是一个在进化上保守的 12 氨基酸区域(命名为 signature2)。最近发现重组的小鼠CRISP-2蛋白也能结合到卵子上， 并能抑制精卵融合213 sLLPl 最近在小鼠和人精子顶体中发现溶菌酶样蛋白 l(spe咖lysozyme-like pmtein 1， SLLP1)，在顶体反应之后出现在人和 小鼠精子的赤道段并且在精卵结合和受精过程中起作用。用重组小鼠 SLLPl(msLLPl)和抗mSLLPl的抗体处理卵母细胞都能显著地抑制精 卵结合。mSLLPl具有潜在的N-乙酰葡糖胺结合残基，因此推测 msLLPl可以结合到透明质酸和/或在卵黄周隙中的相关分子上，并 且向卵膜发出精子已经进入卵黄周隙的信号，然后触发精子吞噬事 件。因为mSLLPl结合位点在受精过程之后消失，所以推测SLLPl 可能阻止多精人卵1111。该蛋白在精子与卵母细胞识别过程中的作用 还有待于基因敲除小鼠的进一步研究。2. 1. 4 Pdi3a研究人员在精 子膜的赤道区发现了蛋白二硫键异构酶(pmteindisulfide isomerase， PDI)家族一些成员“，其中Pdi3a(ERp57)、ERp72和P5位于精子 顶体内，顶体反应后转到质膜的赤道段。用非膜透过性的PDl活性抑 制剂处理获能的精子，能显著减少配子的融合率；用抗Pdi3a抗体处 理精子能抑制精卵融合，说明Pdi3a在哺乳动物配子相互作用过程中 具有重要作用。考虑到在一些病毒的膜融合系统中融合蛋白的激 活需要巯基.二硫键的转换，精卵融合过程中可能也具有一个类似的 机制。精子表面的二硫键异构酶在配子融合的过程中可能触发蛋白质 再折叠。一些在精卵融合过程中作用尚不明确的蛋白质，如精子表面 蛋白Izumo、cRIsPl和卵母细胞表面的四次跨膜蛋白CD9、CD81以 及 CDl51 等，在其细胞膜外结构域中都有二硫键，因而有可能是 Pdi3a 的底物。2. 1. 5 Izumo 2005年，Inoue及其同事们IIIo利用单克隆抗体OBFl3 成功地鉴定出这种在小鼠和人类精卵融合过程中起关键作用 的精子表面蛋白，并取名为Izumoo Izumo是目前鉴定的惟一一个精 卵融合必需的精子蛋白，其分子的中部有一个免疫球蛋白结构域，因 此推断其为免疫球蛋白超家族的一个新成员，但功能不明。人和小鼠 的 Izumo 位于精子质膜下面，只有在顶体反应之后暴露在整个精子头 部的赤道面膜外。sosnik等旧u研究发现，在顶体反应过程中Izumo 将发生从顶体头部到包括顶体后区在内的其它位置的再定位，并且此 过程需要Tssk6的作用。最近又发现Izumo是一个包含Izumo do main 的家族，成员有 Izumo l、 Izumo 2、 Izumo 3 和 Izumo 4 四种蛋 白，其中Izum01-3是跨膜蛋白，在睾丸中特异表达，Izumo 4是可溶 性蛋白在睾丸和其它组织中都有表达，它们都能与精子上的其它蛋白 形成复合体，从而改变局部精子膜结构12“。Izumol蛋白结构域是 由两个非常保守的半胱氨酸之间的二硫键形成的，考虑到二硫异构酶 Pdi3a对精卵融合的重要性，Izumol上潜在的二硫键可能在精卵融合 过程中被二硫异构酶切开，从而引发一系列的构象变化，以与病毒融 合因子相似的机制促使精卵融合忙引。Izumo的细胞外免疫球蛋白结 构域中具有一个位置保守的潜在的N糖基化位点，此位点的糖基化 虽然不是 Izumol 介导精卵融合所必需的修饰作用，但能增加 Izum01 的稳定性III。22 与精子相互作用的卵子蛋白在对精卵相互作用的研究中发 现卵膜上也有多种蛋白可能是卵子与精子结合和或融合的配体。如 整合素(尤其是仪。 B。 )、糖磷脂酰肌醇锚定蛋白和四次跨膜蛋白。2. 2 l Integrins整合素蛋白(integrin)是一种由仅和B两个亚单位 组成的异二聚体膜蛋白质家族，在不同的体系中介导细胞与细胞或胞 外基质相互作用。现已发现由18种0【亚基和8种B亚基组成了 24 种不同的整合素蛋白。在mRNA或者蛋白质水平上都检测到哺乳动 物的卵细胞中有一些种类的整合素亚单位0【2、d3、仅4、0【5、 Q6、dv、d9、0【M、Bl、B2、B3和B5旧51。最早关注的整合素0 【。p。可能是多种与精卵相互作用有关分子的受体旧“。在多种物 种的研究结果显示，当用抗整合素亚基的抗体或者整合素封闭多肽处 理卵细胞后，精卵相互作用将会减弱”“。但所观察到的效果也因体 外受精条件和抗体而异，某些抗整合素抗体能部分或显著地抑制精卵 相互作用，然而，基因敲除研究结果显示缺失多种整合素组合的小鼠 卵子仍然能正常受精旧引，整合素在人类也不是必需的。尽管如此， 整合素仍然可能以某种方式参与配子的相互作用。2. 2. 2 GPIAps糖磷脂酰肌醇锚定蛋白(glyco sylphosphatidylinositol(GPI) anchored proteins, GPIAps)通过一个 GPI脂质锚形体共价结合在细胞表面的脂质双分子层上。coonrod等 则利用特殊的磷脂酰肌醇.磷脂酶C(PI. PLc)特异地切割无透明带的 卵细胞表面的GPI-Aps,导致精子与卵细胞结合减少并且完全抑制了 精卵融合，表明GPI-Aps在这个过程中起作用。Alfieri等利用 Cre / loxP体系，特异性地敲除卵母细胞中GPI生物合成第一步的 N.乙酰葡萄糖胺转移酶的一个亚基Pig-A基因。敲除后的雌性小鼠 只有少数卵细胞(1)能在体内受精，也说明卵细胞上的 GPIAps 对于受精作用的重要性。但是由于GPIAps涉及到多种细胞途径， 包括细胞信号传导、脂膜运输和细胞粘着，这些不同的途径都可能与 精卵作用有关，因此GPIAps在受精过程中的作用需要进一步确定。223 Tetmspanins 在真核生物中广泛表达的四次跨膜蛋白(Tetraspanins)是一个蛋白超家族，它们穿越真核细胞质膜四次，N 一 末端和C 一末端位于细胞膜内，细胞膜外形成两个胞外环：小胞外环 (SEL)和大胞外环(LEL)。LEL包含不变和可变两个结构域。四次跨膜 蛋白的一个重要生物学特征是它们在膜组织过程中的作用并且介导 蛋白质之间相互作用“。整合素、免疫球蛋白超家族的成员和膜锚 定生长因子全都能与四次跨膜蛋自发生初级相互作用引。四次跨膜 蛋白也能与其它四次跨膜蛋白进行二级相互作用，如CD81与CD9 和 CDl5l 相互作用。结果形成一个与四次跨膜蛋白直接或间接结合的 巨大的四次跨膜蛋白网络“。四次跨膜蛋白网络形成了富含四次跨 膜蛋白的微结构域，为多种蛋白分子合作提供了平台。 CD9 是目前鉴 定的惟一精卵融合必须的卵子蛋白。 CD81 也与精卵相互作用有关。 CD9和cD8l双敲除小鼠表现出完全不育“，并且显示CD9和CD8l 在精卵融合过程中起了补充作用，它们的一个共同配体EwI. F存在 于新排出的卵母细胞上，并且可能在精卵融合过程中起关键性的作用 “。ziyyat等旧刊证明cD9控制人类和小鼠卵母细胞质膜上包含d。 B,的整合素的形成和群集。受精过程中整合素通过补体C3片段作 为精子CD46和卵CDllb / CD18的桥连配体，促进精子顶体内膜与卵 膜的融合6 。最新研究表明，识别CD9的LEL的一个单克隆抗体 K41确实能诱导CD9在两个接触的细胞膜之间聚集成拉链状的微绒 毛样凸起，凸起中还发现有其它的四次跨膜蛋白成员CD63、CD81、 CD82以及与CD9结合的整合素（1和EwI-F “。但Miyado等一副 最近证明包含有CD9的小泡在精卵膜融合之前就先与精子膜相互作 用，推测卵子释放出包含有CD9的小泡促进了与精子的融合能力有 趣的是，人类的卵细胞与小鼠的卵细胞相比可能依靠不同的四次跨膜 蛋白。23 精卵结合与融合的模型 尽管基因组学和蛋白组学的研究发现了大量的在精卵相互作用 过程中有可能起作用的配子细胞表面分子，然而对精卵结合与融合的 了解仍不全面。Nixon等旧副提出了一种与病毒细胞融合过程相似的 模型。精子表面受体与卵母细胞表面受体结合，引发了由巯基改变介 导的蛋白重折叠。CD9和其配体蛋白调节精子和卵母细胞紧密靠近, 导致精子质膜上的组分（如Izumo）与四次跨膜蛋白网络介导的卵子表 面脂筏微区域内的分子复合体相互作用，最终导致细胞融合IIJ。但 考虑到还有更多的成员被揭示为精卵相互作用的候选分子，目前公认 的关键分子CD9和Izumo各自在精子和卵子上的受体分子仍不清楚, 配子膜上的糖和脂类的作用也有待于确认，上述分子模型还需要进一 步补充和完善。3 展望哺乳动物受精是一个具有种属和细胞特异性的极为精巧的过程， 也是生命体最有意义的细胞识别和相互作用之一。了解这一过程的细 胞与分子机制，不仅对理解生命的起源和延续具有重要的理论价值， 也对人类不育症的临床诊治以及开发新的靶向生殖调节药物具有实 践指导意义。参考文献1.ShurBD.Reassessing thero leofprotein-carbohydrate comple mentarityduring sperm-egg interactions in the mouse.IntJDevBiol,2008,52(5-6):703-715.2. 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