蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分 子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或 生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得 特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白免疫印迹(Western Blot)是将电泳分离后的细胞或 组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然 后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已 广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病 早期诊断等多个方面。中文名 蛋白质印迹法 外文名 Western Blot 蛋白免疫印迹 Western Blot类似方法1Southern Blot杂交方法类似方法2Northern Blot杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳 1原理与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAG （聚 丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自 显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技 术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 1分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实 验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二 抗用HRP标记)：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP, 即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。操作步骤试剂准备1、SDS-PAGE试剂：见电泳实验。2、匀浆缓冲液：1.0MTris-HCI(pH6.8)1.0ml；10%SDS6.0ml； 0-巯基乙醇 0.2ml ； ddHO 2.8ml。23、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g; Tris 5.8g; SDS 0.37g；甲醇 200ml ；加 ddH O 定容至 1000ml。24、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；NaHPO41.44g；2KH PO4 0.24g ；加 ddH O 至 1000ml。225、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml ；乙酸2ml；ddH01182ml。包被液(5%脱脂奶粉，现配)：脱脂奶粉1.0g溶于20ml 的 0.01M PBS 中。6、显色液：DAB 6.0mg； 0.01M PBS 10.0ml ;硫酸镍胺 0.1ml ； H0 1.0。22样品制备1、单层贴壁细胞总蛋白的提取：(1) 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液 (或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。(2) 每瓶细胞加3ml 4C预冷的PBS (0.01M pH7.27.3)。平 放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次， 共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。(3) 按1ml裂解液加10PMSF (100mM),摇匀置于冰上。 (PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。(4) 每瓶细胞加400 丨含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min, 为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。(5) 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作 要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中(整 个操作尽量在冰上进行)。(6) 于4C下12000rpm离心5min (提前开离心机预冷)。(7) 将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于一20C 保存。2、组织中总蛋白的提取：(1) 将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的 剪刀将组织块尽量剪碎。(2) 加400 uL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中， 进行匀浆。然后置于冰上。(3) 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽 量碾碎。(4) 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心 管中，然后在4C下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml 离心管中并置于一 20C保存。3、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按(一)操作 外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提 取：(1) 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5mino(2) 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm 离心5mino弃上清后用PBS重复洗涤一次。(3) 用枪洗干上清后，加100 uL裂解液(含PMSF)冰上裂 解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。(4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4C、12000rpm离心 5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于一20C保存。含量测定1、制作标准曲线(1 )从一20C取出1mg/ml BSA,室温融化后，备用。(2) 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 ng, 2.5|dg,5.0|dg,10.0ug,20.0|dg,40.0|dg。(3 )按下表在各管中加入各种试剂。0g2.5g5.0|ig10.0g20.0g40.0|ig1mg/ml BSA2.55.010.0J20.0J40.0J0.15mol/LNaCl10097.5J95.0J90.0J80.0J60.0|ilG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml(4) 混匀后,室温放置 2min。在生物分光光度计(Bio Photometer, Eppentoff) 上比色分析。2、检测样品蛋白含量(1)取足量的1.5ml离心管，每管加入4C储存的考马斯亮蓝 溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。(2 )取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100ml,混匀 放置2分钟可做为空白样品,将空白倒入比色杯中在做好标准 曲线的程序下按blank测空白样品。(3 )弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL), 再用无菌水洗一次。(4) 取一管考马斯亮蓝加95ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和 5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按 sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次,无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的 蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是 5ml 样品含的蛋白量。 SDSPAGE 电泳1、清洗玻璃板 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦 洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2、灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌 胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。（2） 按前面方法配 10%分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可 灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升 到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝 的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速 度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。 加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）（3 ）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。（4 ）按前面方法配4%的浓缩胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可 灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶 时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使 梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔 的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补 胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻 轻将其拔出。（5 ）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板 面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一 块塑料板且有字的一面面向外。）（6）测完蛋白含量后，计算含 50ng 蛋白的溶液体积即为上样 量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5XSDS上样缓冲液 至终浓度为1X （上样总体积一般不超过151,加样孔的最大限度可加20样品）。上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋 白变性。（7）加足够的电泳液后开始准备上样（电泳液至少要漫过内测 的小玻璃板）。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要 吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样 太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入 下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免 交叉污染。3、电泳电泳时间一般45h,电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴 酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。1、转一张膜需准备 6 张 7.08.3cm 的滤纸和 1 张 7.38.6cm 的 NC 膜或 PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的 蛋白会污染膜。将切好的 NC 膜或 PVDF 膜置于水上浸 2h 才可使 用。用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜 浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整 个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样 会阻止膜吸水。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、 两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。2、将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用 玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡（一手擀另一手要压住垫子 使其不能随便移动）。在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在 一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气 泡。3、要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个 边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻 板（撬时一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，将浓 缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小 心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用 玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可 再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上 另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进 行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后 会发生短路（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门 以使空气流通）。4、将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白 面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰，或将 转移槽埋于冰水混合物中来降温。一般用80V转移1h，或60V 转移2h，或40V转移3h。5、转完后将膜用1X丽春红染液染5min （于脱色摇床上摇）。 然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干 备用。免疫反应1、将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室 温下脱色摇床上摇动封闭 1h。2、将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下 适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使 保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出 膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上， 掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育12h后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min;再用TBS洗一次， 10min。3、同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，重复步骤（2）中最 后一步，进行化学发光反应。化学发光1、将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜 蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜 膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。2、在暗室中，将1X显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红 灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均 需大1cm）;打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上， 便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当 调整曝光时间，一般为1min或5min,也可选择不同时间多次 压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X- 光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止 显影。显影时间一般为12min （2025C），温度过低时（低 于16C）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸 入定影液中，定影时间一般为510min，以胶片透明为止；用 自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手 指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分 子量和净光密度值。其他值得一提的是，western blot这个名称的由来很有意思。最开 始做印迹工作的是一个叫做Edwin Southern的科学家，但印迹 的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来类 似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针 对RNA，一个针对蛋白质，人们分别把这两种技术称为northern blot （由斯坦福大学的George Stark发明）和Western blot， 这两个技术的命名与发明人的名字没有关系了。 2-3