端粒相关蛋白相互作用网络及端粒复合物的结构和功能

端粒相关蛋白相互作用网络及端粒复合物的结构和功能利用双荧光分子互补技术(BiFC)平台、蛋白质组学平台和生物信 息学平台，研究端粒蛋白复合体及端粒酶的蛋白相互作用网络。规模 化地系统筛选和鉴定一批新的人端粒相关蛋白，阐明新蛋白与端粒体 主要蛋白成分和端粒酶的相互作用机制及其对端粒长度的调控机制。 对新发现的关键端粒相关蛋白进行结构解析。研究方法：(1) 筛选和鉴定新的端粒相关蛋白,构建端粒蛋白复合体的蛋白 互作网络：针对前期工作中以BiFC技术平台筛选出的，与端粒体 中两个直接调控端粒酶的主要蛋白(TPP1和P0T1)相互作用的100 多个潜在的端粒相关蛋白，通过构建 Flag 标签的蛋白表达载体方法 和逆转录病毒技术使筛选蛋白在活细胞内表达后，利用免疫沉淀和 GST沉淀等方式确认其与端粒体蛋白的相互作用关系。针对其中可 能与端粒 DNA 直接或间接结合的蛋白，进行免疫荧光染色的端粒共定 位实验。用EMSA实验证实新蛋白是否与端粒DNA直接结合。利用 分子生物学、蛋白质组学和细胞生物学等方法，确定这些端粒相关蛋 白的功能，重点利用四环素调节表达系统、 RNAi (RNA Interference) 、 ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) 、 TRF( Telomere Restriction Fragment ) 、 QFISH (Quantitative Fluorescent In Situ Hybridization) 、 TRAP (Telomere Repeat Amplification Protocol) 等技术阐述端粒相关蛋白对端粒长度和端粒酶活性的调控机制，并依 此建立以端粒体蛋白 TPP1 和 POT1 为中心的蛋白相互作用网络，为进 一步深入研究细胞分化、衰老和某些重大疾病提供新的重要的端粒相 关蛋白靶点。(2) 构建端粒酶 TERT 的蛋白相互作用网络:端粒酶是多蛋白复合体。端粒酶的作用受到多个端粒结合蛋白以及端粒酶全酶(holoenzyme)中的多个辅助因子的调节。恶性肿瘤细胞普遍表达 TERT并具有很高的端粒酶活性，我们拟以TERT为核心，运用BiFC 等蛋白质组学技术，系统地筛选和鉴定肿瘤细胞中与TERT相互作用 的蛋白，寻找端粒酶中其他尚未发现的重要组分。结合我们用酵母双 杂交技术筛选出的与TERT相互作用的蛋白数据，经GST沉淀等方式 确认其相互作用关系，用BiFC进一步研究关键TERT结合蛋白(如 hnRNP Al)的相互作用，以及其对端粒长度的调控。(3) 端粒相关蛋白对端粒DNA 3 G链悬突(overhang)产生和 端粒酶延伸端粒DNA的调节机制：我们将分析鉴定新的端粒酶和端粒 体结合蛋白在对端粒overhang的产生和调节作用。我们创建和发展 的独特方法可以准确地测定端粒overhang长度。细胞内端粒酶有两 种延伸模式：进行性(processive)和分步性(distributive)。我们将 利用现有的实验平台研究端粒酶调节端粒延伸的分子机理，定量地分 析在单个细胞周期内端粒酶对细胞内端粒的延伸情况，进而分析新发 现的端粒相关蛋白如何影响细胞内端粒酶的作用，丰富端粒酶活性调 节的蛋白网络。(4) 对新发现的端粒相关蛋白复合体进行结构研究：选择3-4 个新发现的关键的端粒相关蛋白，对蛋白-端粒DNA或蛋白-蛋白复合 物进行结晶实验，获得高质量晶体，解析复合物的三维结构。根据结 构分析，对参与特异性相互作用的重要氨基酸突变来验证晶体结构并 作功能分析。利用解析的结构信息，在数据库中搜索具有同源结构的 蛋白，结合制作模型的方法和通过信息学手段，研究新蛋白与端粒结 合蛋白可能的作用方式。对于难以结晶或存在较高程度无规则结构的 复合物晶体作异核二维NMR光谱分析，研究其构象及其与端粒DNA、 端粒体或端粒酶的相互作用。