焦磷酸测序专题知识讲座培训课件

焦磷酸焦磷酸测序序专题知知识讲座座pyro=pyrophosphatepyro=pyrophosphate焦磷酸焦磷酸一种一种全新的全新的基于酶级联反应的基于酶级联反应的新型新型遗传分析技术遗传分析技术;一套完整的实验方案；一套完整的实验方案；诸多领域的广泛应用诸多领域的广泛应用 Pyrosequencing遗传分析技术遗传分析技术PyrosequencingPyrosequencing这项专利技术完全由这项专利技术完全由BiotageBiotage公司拥有公司拥有2焦磷酸测序专题知识讲座PPiATPPrinciple of PyrosequencingAPSLuciferin硫酸化酶硫酸化酶双磷酸酶双磷酸酶荧光素酶荧光素酶oxyluciferin3焦磷酸测序专题知识讲座Detection of the lightlighttime4焦磷酸测序专题知识讲座 C G TT CC A CC T N 每次向反应体系中加入一种每次向反应体系中加入一种dNTPN 相应位置的峰代表该种相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况的掺入情况N 峰高与掺入的核苷酸数量成正比峰高与掺入的核苷酸数量成正比N 多余的多余的dNTP在加入下一种在加入下一种dNTP前就被降解前就被降解5焦磷酸测序专题知识讲座A complete solution for accurate genetic determinationPyrosequencing 系统平台系统平台Reagent Kits Sample Prep WorkstationSoftwareInstrumentation6焦磷酸测序专题知识讲座PyroMarkTM IDComplete solution for Clinical MicrobiologyPyrosequencing 系统平台系统平台Assay Design SW Sample Prep PyrosequencingFeaturing Pyro Gold chemistryIdentiFireTM SW7焦磷酸测序专题知识讲座Pyrosequencing 技术的流程技术的流程PCR试样预处理，获得单链模板P Pyrosequencingyrosequencing序序序序列分析列分析列分析列分析15 min/96 samplesSQA:35 min/96 samplesSNP:10min/96 samples1-2h/96 samples结果分析结果分析实验设计实验设计8焦磷酸测序专题知识讲座 Peak height is proportional to the number of incorporated nucleotidesAllele 1:ACTGAllele 2:GCTG杂合子标本杂合子标本:9焦磷酸测序专题知识讲座Genotypes are clearly distinguished纯合子纯合子杂合子杂合子ACTGCCTGCTGCCTA/GCTGCCT10焦磷酸测序专题知识讲座Insertions/deletionsSingle nucleotide InDels(e.g.C)Multiple nucleotide InDels(e.g.CGACGGT)The software supports analysis of insertions/deletions(InDels)11焦磷酸测序专题知识讲座CYP2D6-A2637del(Allele 3)Sequence(reverse):TCC T GTGT/TT/-/-12焦磷酸测序专题知识讲座Large deletion3ATGTGGCATTCCAA5.ACGTACGCTTACACCGTAAGGTTCTAAAGGTGCACCATGACTGGGGTTACAGTCATC.13焦磷酸测序专题知识讲座Microsatellites:TGAATGnTTTGGGCAAAT8/128/84 7 84 7 8 (9)(10)(11)(12)14焦磷酸测序专题知识讲座Tri-and tetra-allelic SNPsC/CT/TG/GC/TC/GT/GGenotyping of tri-allelic SNP(C/T/G)15焦磷酸测序专题知识讲座Multiple polymorphisms 3TAAGCCGAATG5AACATTCGGCTTACAT/GGAATGAA/C/G/TCGGTACGAACGATTTTAGA.16焦磷酸测序专题知识讲座MultiplexingSNPs located on different fragments.or on the same17焦磷酸测序专题知识讲座Principle of multiplexingDesign of sequencing primers and dispensDesign of sequencing primers and dispensatation ion orderorder3,5refref00,511,522,53Relative light unitsTAGCGCACGATGTA/GCCTGCCACCA/GTTGGG Combined TGGACCACCA/GTGGTTGAGA/GCTGCCTG1 12 2TTGAGA/GCTGCCTG00,511,52TAGCGCACGATGTTGGACCACCA/GTGG00,511,52TAGCTGCACGATG18焦磷酸测序专题知识讲座User creates a SNP/mutation sequence databaseSoftware calculates theoretical genotyping resultsEach DNA fragment is assigned a color19焦磷酸测序专题知识讲座Quantitative peak heightsRelative peak height=peak1 height peak1 height+peak2 heightAllelefrequency=relative peak height x 100(%)Relative peak heightAllele frequency(%)0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9001,000010203040506070809010015%30%75%20焦磷酸测序专题知识讲座Advantage and Benefit of PyeosequencingFastAccuracyFlexibilityMultiplexingSimpleSequenceEfficientShort Optimization TimeDedicated SoftwareDedicated Reagent KitScalable21焦磷酸测序专题知识讲座1.Assay DesignExample of a general target:16S geneAssay Design SWSpecies-specific region in 16 S genePCR-forwardPCR-reverseSequencing primer22焦磷酸测序专题知识讲座2.PCR扩增扩增 一对扩增引物中的一条带有生物素标记，另一条不带标记。生物素标记23焦磷酸测序专题知识讲座3.Single Strand Template Preparation PCR产物中加入streptavidine包被的sepharose beads 振荡温育 5-10 min 变性，生物素标记的单链结合于beads并被真空吸附于Vacuum Prep Tool上 洗涤，中和 单链模板加入反应体系，与测序引物退火PCR product immobilized on Sepharose beadsPSQ plate with sequencing primerEtOHNaOHWashingbufferWater24焦磷酸测序专题知识讲座J真实的序列：遗真实的序列：遗传检测的黄金标传检测的黄金标准准J快速的实时输出：快速的实时输出：1 1 碱基碱基/分钟分钟J9696个样本平行处个样本平行处理能力理能力J新一代的新一代的Pyro Gold试剂：表现试剂：表现大为提升大为提升4.PyrosequencingPyroMark ID Instrument25焦磷酸测序专题知识讲座5.Pyrogram Analysissequence result with quality grading96 samples analyzed sequence result(can be exported in FASTA format)26焦磷酸测序专题知识讲座Pyrosequencing技术的特点技术的特点J得到定量序列结果的技术J极高的准确性Built-In QCJ重现性极佳J通用型技术平台功能多样，应用领域极广可以用于任何遗传多态性的分析甲基化研究的平台高通量、低成本的快速临床微生物诊断J实验设计灵活J自动化程度高，操作简单27焦磷酸测序专题知识讲座Why Pyrosequencing is quantitative？lighttime28焦磷酸测序专题知识讲座 1分子的分子的dNTP掺入，释放出掺入，释放出1分子的分子的PPi，生成，生成1分子的分子的ATP，产生单位强度的光信号，产生单位强度的光信号T GG CC GGG T C A C G A GG CCC TA.Triple DoubleSingleWhy Pyrosequencing is quantitative？29焦磷酸测序专题知识讲座1.00.00.50.50.01.0Expected1.09 0.050.550.560.021.05Average0.02 n.d.0.030.03n.d.0.03CVC/CC/GG/Gn=190PyrosequencingPyrosequencing：Quantitative Accuracy TestQuantitative Accuracy Test30焦磷酸测序专题知识讲座E S G C T A G T A G A GC/CE S G C T A G T A G A GT/TE S G C T A G T A G A GC/TWhat are”Inbuilt Controls”?Since Pyrosequencing shows polymorphisms with sequence context,you can always trust the validity of the data.32焦磷酸测序专题知识讲座Benefits of Built-in Quality ControlJQC基于周边的序列信息基于周边的序列信息鉴定的黄金标准鉴定的黄金标准从从primer后的第一个碱基开始后的第一个碱基开始便于数便于数据据alignmentJQC 验证了实验的成功与否验证了实验的成功与否具体到每一轮的每一个样品具体到每一轮的每一个样品万一实验失败，可以帮助分析原因，解决万一实验失败，可以帮助分析原因，解决问题问题33焦磷酸测序专题知识讲座Pyrosequencing焦磷酸测序系统的卓越表现：99.998%accurate(based on analysis of 100,000 wells with known genotype)34焦磷酸测序专题知识讲座Integrated Software Package整合且不断扩展的软件包整合且不断扩展的软件包 SNP-SNP and mutation analysis AQ -Included in SNP software-Easy statistics function SQA-Base calling-Sequence alignmentAll three with quality assessmentRunningAnalyzingPlanningDocumenting35焦磷酸测序专题知识讲座Pyrosequencing的应用的应用Sequence analysis Sequence identification Microbial typing Cloned DNA re-sequencing mtDNA/Forensics Transgenetics Expression profiling Oligo ID Microsatellites Known positions Unknown positions within hot spots Point mutations Insertions/deletions Multiple mutations MultiplexingMutation detectionQuantification Allele frequency assessment SNP frequency Tri/tetra allelic SNP frequency Indel frequency CpG-methylation Gene copy number Loss of heterozygosity Polyploid genomes Expression analysesGenetic variation SNPs and DIPs Di-,tri-and tetra allelic Multiple Multiplexing Haplotype Out-of-phase Allele-specific PCR36焦磷酸测序专题知识讲座已发表的文章已发表的文章37焦磷酸测序专题知识讲座使用使用Pyrosequencing技术发表的研究报告已近千篇技术发表的研究报告已近千篇38焦磷酸测序专题知识讲座发表在Nature、Science上的文献39焦磷酸测序专题知识讲座快速鉴定炭疽热细菌快速鉴定炭疽热细菌Bacillus anthracis 炭疽是一种人畜共患疾病。引起炭炭疽是一种人畜共患疾病。引起炭疽病的炭疽杆菌以孢子形式存在于土壤疽病的炭疽杆菌以孢子形式存在于土壤中，在特定条件下，可以存活数十年。中，在特定条件下，可以存活数十年。炭疽热的潜伏期为炭疽热的潜伏期为1到到6天，彻底发天，彻底发病则在多达病则在多达60天后。抗生素能够抑制炭天后。抗生素能够抑制炭疽热感染，但条件是必须在接触炭疽热疽热感染，但条件是必须在接触炭疽热细菌后的细菌后的48小时以内使用。小时以内使用。40焦磷酸测序专题知识讲座 炭疽杆菌炭疽杆菌Bacillus anthracis(B.anthracis)是引起炭疽热严重感染的病原是引起炭疽热严重感染的病原细菌。从接触病原体到症状最初出现的细菌。从接触病原体到症状最初出现的感染发展过程一般为感染发展过程一般为1到到6天。如果确认天。如果确认受到受到B.anthracis攻击攻击,利用抗生素或解毒利用抗生素或解毒剂可以防治其感染剂可以防治其感染,因此快速鉴定病原微因此快速鉴定病原微生物种类和其致病力状态具有很重要的生物种类和其致病力状态具有很重要的意义。在起初意义。在起初24-48小时内摄入抗生素可小时内摄入抗生素可以防治其传染。以防治其传染。41焦磷酸测序专题知识讲座 B.anthracis的致病菌株有两个质粒的致病菌株有两个质粒,pXO1含炭疽热毒素产生的基含炭疽热毒素产生的基因因(lef,cya,pag).pXO2编码包装和孢子形成所必须的产物编码包装和孢子形成所必须的产物.被称为被称为Ba813的一段的一段DNA序列是序列是B.anthracis的一个特异染色体标的一个特异染色体标记记,是是B.anthracis区别于与其紧密相关的其他土壤杆菌种的标志区别于与其紧密相关的其他土壤杆菌种的标志.pXO1Anthrax toxinpXO2Encapsulation factor42焦磷酸测序专题知识讲座B.anthracis assay design2)determine presence of pXO1 and/or pXO21)identify bacteriumFragment Ba813ChromosomeATACCGTATC AGCAAGCTAT pXO1AAGATATTAT CAAGGGATATpXO2ACCACTCATT AAGTTCTTCGProf.Lars Engstrand et al.,Uppsala University43焦磷酸测序专题知识讲座B.anthracis:raw dataCalled sequence:ATACCGTATC AGCAAGCTAT TCCCalled sequence:AAGATATTAT CAAGGGATAT TTTAAGTAAA ATTAATCAAC CATCalled sequence:ACCACTCATT AAGTTCTTCG CACCGCTAAA CASpecies-specific chromosomal fragment(Ba813)lef gene:anthrax toxin production(pXO1)cap gene:capsule formation(pXO2)44焦磷酸测序专题知识讲座B.anthracis:Result45焦磷酸测序专题知识讲座谢谢！46焦磷酸测序专题知识讲座