MicroRNA及基因的调控

MicroRNAmicroRNA（miRNA）是广泛存在于真核生物中的一组短小的，不编码蛋白质的RNA家族,其在细胞内具有多种重要的调节作用。miRNA主要通过与其靶基因mRNA的3-UTR端互补结合降解mRNA或是抑制mRNA的翻译从而阻遏基因的表达。最近的研究中表明，人类肿瘤中的miRNA的失调与癌症的发病（包括发展和转移的作用）有重要的关系。MicroRNA的特点（1）广泛存在于真核生物中, 是一组不编码蛋白质的短序列RNA , 它本身不具有开放阅读框架(ORF) ;（2）通常的长度为2024 nt , 但在3端可以有12 个碱基的长度变化;（3）成熟的miRNA 5端有一磷酸基团, 3端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA 的降解片段区别开来；（4）多数miRNA 还具有高度保守性、时序性和组织特异性。MiRNA的作用机制miRNA在发挥作用之前，需要同细胞内一些协同因子结合形成蛋白质- RNA复合物（miRNA-containing ribonucleoprotin，miRNP），在miRNP的作用下指导其识别同源mRNA。在Hela细胞裂解液中发现这类RNA蛋白复合物的大小在15S左右，其主要成分为Germin3、Germin4和Argonaute蛋白家族成员eIF2C2因子,后两种蛋白质与运动神经元的存活(survival of motor neurons,SMN)有关。研究认为，miRNP即为RISC.miRNA与靶mRNA作用的典型方式主要有两种：在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA 与靶mRNA的3 UTR不完全互补配对，阻断该基因的翻译过程，从而调节基因表达。这种方式只影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。目前，该翻译抑制的详细机理尚不清楚。最近有研究对此提出质疑，他们认为，正常衰退途径引起的mRNA降解速度的升高也会导致蛋白质表达水平的下降，且miRNA不仅能作用于翻译起始后的延长阶段，还能够抑制翻译的起始。被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P-bodies的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。然而，P-bodies可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，并且，减少一些特定P-body组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制。P bodies是胞浆中的一定区域，它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、无义介导mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay ,NMD)，转录抑制及RNA介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。尽管P bodies不是介导基因沉默所必需的，但阻断siRNA或miRNA基因沉默途径的任何一步都会阻碍P-body的形成，这表明P-body是基因沉默的结果。因此，尽管P-body成分在mRNA沉默及衰退中起重要作用，但P-body中的这种聚集并不是介导基因沉默机制所必需的，而只能作为他们活动的结果。另一种作用方式是，当miRNA与mRNA完全互补配对时，引起目的mRNA在互补区的特异性断裂，从而导致基因沉默，这种作用方式与 siRNA类似。如大多数植物在可读框(ORF)中与它的靶位点几乎完全配对。这种mi/siRNA介导的基因沉默机制已得到了相关的阐释。以siRNA参与的RNAi为例进行说明，siRNA可与RISC结合,作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也称为转录后基因沉默(PTGS)。miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。MiRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达方式作用；miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。MicroRNA与癌症一、 miRNA作为抑癌基因（1） miRNA-15miRNA-16与慢性淋巴性白血病Calin等的研究首次证明miRNA的失调在肿瘤的发生中起着非常重要的作用。MiRNA-15和miRNA-16定位于染色体13q14区段，该区段的局部丢失与慢性淋巴性白血病(CLL相关)，在检测的CLL病患中，有近68的这两种miRNA完全缺失或表达下调。另外，在前列腺癌(60)、外套淋巴细胞瘤(50)和多发性骨髓瘤(1640)等肿瘤中也常有该区段的缺失。Bcl-2蛋白是一种通过作用于线粒体来抑制细胞凋亡的蛋白，对于癌细胞的存活起着非常重要的作用。Cimmino等证实miRNA-15和miRNA-16的表达水平均与BCL-2蛋白的表达水平负相关，并且二者都在转录后水平通过靶向作用负调节BCL-2其对BCL-2的抑制诱导了白血病细胞的凋亡。因此，miRNA-15、miRNA-16是BCL-2的天然的反式作用因子，对BCL-2过表达的肿瘤具有潜在的治疗作用。（2） let-7家族负向调控Raslet-7家族是首批发现的miRNA之一，早期的研究表明，其功能的缺失将阻碍线虫从幼虫晚期向成虫的转化。let-7对于诱导细胞周期的退出和终末分化是非常必要的如果这miRNA缺失，将导致细胞不能退出细胞周期，不能分化，这种现象在癌症中很常见。人类Ras蛋白家族是众多信号级联放大系统中的最重要的成分之一，具有原癌基因的活性，通常在肿瘤中表达异常，并与细胞的恶性化倾向有着密切联系。Johnson等研究发现let-7家族通过与Ras基冈的3UTR区中多个let-7补充位点(LCS)结合，负向凋控Ras信号转导通路。实验表明，如let-7miRNA的表达水平在肺癌组织要低于正常肺组织，然而Ras蛋白在肺癌组织中显著的高表达，为let-7miRNA在癌症中的作用提供了一个可能的机制。Akao等的研究表明，let-7在结肠癌中也起着肿瘤抑制因子的作用。Bmeckner等研究发现。人类let-7a-前体miRNA可以作为肺腺癌中后生的调节性miRNA基因，具有原癌基因的潜能，该基因的甲基化可能导致人类癌症的发生。（3）其它miRNA作为抑癌基因Ciafre等的研究发现在成胶质细胞瘤中，miRNA-128、miRNA-181a、miRNA-181b和miRNA-181c表达均下调。Pekarskv等的研究发现，miRNA-29和miRNA-181的表达水平与Tcl-l在CLL中的表达反相关，表明miRNA-29和miRNA-181可以作为治疗由TCL-1过表达引起的CLL的候选基因。Akao等发现miRNA-143和miRNA-145的表达水平在结肠癌细胞中显著下降。二、 miRNA作为癌基因（1）调节myc的miRNAmyc是一个通过调控细胞增殖和死亡，从而调控细胞生长的转录因子。myc经常在人类癌症中突变或放大。miRNA-155与myc的过表达与B细胞淋巴瘤有关，这表明它可能在这一肿瘤基因的调控过程中起着重要的作用。miRNA-155最初是作为转录物由BIC的241264核苷酸编码，从ALV的(禽白血病病毒)的整合位点中分离出来的，并发现在B细胞淋巴瘤中过表达。Metzler等分析了BIC中系统发生的保守区域发现高同源性位于基因的一个138核苷酸的区段，该区段编码了miRNA-155的pri-miRNA。随后实验表明，miRNA-155的表达在小儿伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的特定亚型中的表达上调了100倍。然而，miRNA-155的作用不仅仅限于B细胞淋巴瘤，最近的研究报道了miRNA-155在乳腺癌、肺癌、结肠癌和甲状腺癌中均有上调。Costinean等的实验显示，在E操纵子的控制下，鼠miRNA-155的过表达使B细胞恶性肿瘤迅速发展，表明在没有其它主要基因变化的情况下，miRNA-155具有诱导淋巴瘤生成的能力，是一个癌基因。与myc的相互作用并不是miRNA-155所独有的。最近的研究描述了myc、癌症和13q3l位点之问的相互关系。MiR-17-92簇由7种miRNA(miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、MiR-20a、miR-19b-1和miR-92-1)组成，位于13q31.3的Cl3orf25的内含子其扩增和过表达可以作为淋巴瘤和肺癌有关的功能相关指示器。He等比较了正常组织和B细胞淋巴瘤样本，发现从MiR-17-92位点衍生出来的前体和成熟miRNA，在癌细胞中大量增加，miRNA作为癌基因调节肿瘤的形成。在随后的试验中发现miR-17-19b-1在携带myc转基因鼠的造血干细胞的逆转录病毒系统中过表达。受到致命性辐射的动物，分别接受miR-17-19b-1和myc均表达的造血干细胞和只表达myc的造血干细胞，发现前者的恶性淋巴瘤的发展要快于后者，并且，前者具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的能力。通过生物信息学的预测发现，MiR-17-92簇中的miR-17-5p和miR-20a成员，以转录因子E2Fl为靶目标。E2Fl是通过调节与DNA复制、细胞分裂和凋亡相关的基因来调节细胞周期从Gl期向s期的转变。（2） miRNA-21作为癌基因在所分析的实体瘤（乳腺、结肠、肺、前列腺、胃和内分泌腺、恶性胶质瘤、子宫平滑肌瘤）中唯一均表达的miRNA是miRNA-21。miRNA-21位于染色体17q23.2上的空泡膜蛋白基因的3UTR区，该区域经常发现在神经细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和肺癌中表达增强。在恶性胶质瘤细胞中，miRNA-21的敲除导致了半胱天冬酶介导的编程性细胞死亡更进一步支持了这一miRNA作为癌基因的作用的观点。与正常的乳腺组织相比，miRNA-21在乳腺癌组织中高水平表达。anti-miRNA-21介导的细胞生长的抑制与细胞凋亡的增加和细胞增殖的降低有关。结果表明，miRNA-21作为癌基因通过对Bcl2的调节来调控肿瘤的发生，并且可以作为治疗的靶位点。三、miRNA与肿瘤的早期诊断Cimmino等研究发现，miR-15a和miR-16-1消极调节其靶基因一致癌基因BCL2，BCL2在人类多种癌症包括白血病和淋巴瘤中过度表达。因此，我们可以认为miR-15a和miR-16-1的缺失或下调导致BCL2表达增加，促进白血病和淋巴瘤的发生。在Burkitt淋巴瘤中，miR-155的表达量上调，在肺癌细胞系中miR-26a和miR-99a的表达量下调。miR-21在恶性胶质瘤和乳腺癌中的表达是上调的。Chan等报道，miR-21在恶性胶质瘤中表达水平比正常组织高5-100倍，在恶性胶质瘤中对miR-21的反义研究发现，这种miRNA通过抑制凋亡而不影响细胞增生来控制细胞生长，提示miR-21有致癌作用。人肿瘤中表达异常的miRNA有许多：miR-55BIC基因在Burkitt淋巴瘤中表达上调，而miR-15a、miR-143、1et-7、miR-21基因在B细胞慢性淋白血病中表达呈下调趋势。以上证据均提示，肿瘤的发生、发展与miRNAs表达水平之间存在着特定的关系。miRNA调控靶基因的表达，通过正常细胞和肿瘤细胞中的某些miRNA水平的差异显示，为肿瘤的组织诊断、分型及治疗提供了依据。因此，针对各种肿瘤制定miRNA表达谱的基因库可能对于肿瘤的诊断治疗有重要意义。实验证明，在多种恶性肿瘤组织中miRNA的表达高低不同，且与其在相应正常组织中的表达存在显著差异，但同一组织来源或同一分化状态的肿瘤有类似的miRNA表达谱。miRNA表达谱分析不仅可反映肿瘤的组织来源，而且还可反映肿瘤的分化状态，尤其是低分化型肿瘤。Bottoni等通过微点阵和逆转录聚合酶链式反应方法分析垂体瘤和正常垂体样本中的miRNA组(miRNAome)，指出miRNA表达能够区分微腺瘤与大腺瘤、处理过的患者样本与未处理样本。Lee等通过原位逆转录聚合酶链式反应的应用，在胰腺癌细胞中发现表达异常的miR-221、miR-301和miR-376a，而在基质、正常的腺泡或腺管中却未能发现。miRNA的异常表达为胰腺肿瘤的研究提供了新的线索，同时也可能会给胰腺癌的诊断提供生物标记。研究人员在血浆和血清等血液成分中发现了miRNA分子，表明由肿瘤细胞产生的miRNA分子可能由于胞吐作用进入血液循环中，从而又为肿瘤的早期诊断提供了良好的检测媒介。此外，miRNA研究的相关技术日益完善，如基因芯片、逆转录聚合酶链式反应和Northem印迹杂交等方法，检测miRNA的表达水平将能与临床相结合，为肿瘤的基因诊断打下坚实的基础。根据miRNA在不同的肿瘤细胞中特定的表达水平和模式，人们可以将人乳腺癌、肺癌、结(直)肠癌、颅脑肿瘤、甲状腺癌和淋巴瘤等组织中的miRNA表达谱与其正常组织表达谱进行对比分析，对不同肿瘤特定的miRNA水平进行鉴定，通过其表达水平的上调或下调来获得肿瘤的发生信息，从而有助于肿瘤的早期诊断和治疗。四、 miRNA与肿瘤细胞的转移研究表明，miR-21通过对靶基因的调控，参与了肿瘤细胞的侵袭、血管浸润和转移。结、直肠癌患者miR-21高表达，与肿瘤的远处转移相关；乳腺癌的肿瘤分期随miR-21的升高而进展，并有可能转移到肝脏组织。miRNA被癌细胞释放进入血液循环中，而癌细胞的转移是通过血液途径和淋巴途径进行的，说明miRNA有可能对癌细胞的转移有特定的作用。研究者在血浆和血清等血液成分中发现的miRNA，可以在室温放置24h之后反复冻融8次而保持稳定，并且这种分子独立于细胞之外，也不能被血液中降解其他RNA分子的酶降解，表明由肿瘤细胞产生的miRNA分子进入血液循环中，可能对肿瘤细胞的转移和正常细胞(组织)的调控具有一定的作用。Hadi发现，独立于细胞之外的mRNA和miRNA的转移是一种新奇的细胞间的遗传交换机制，细胞外的mRNA和miRNA可以通过细胞吞噬作用转移进入另一个细胞中，并且在另一个细胞中新的位置可以行使其功能，这类RNA叫做“体外穿梭RNA”。因此，存在于癌症患者血液中的miRNA很可能进入到正常的细胞中，这些miRNA可以控制基因的表达，从而引发新的肿瘤，导致癌症的转移和复发。癌症的转移因素很多，现在的推测只是一种可能性，对癌症转移的研究还需要漫长的探索。了解癌症转移机制，从分子水平阻断导致癌细胞转移因子的方法来治疗癌症已经成为一种新的策略。MicroRNA与其他一些疾病一、MicroRNA与系统性红斑狼疮研究人员首次发现系统性红斑狼疮的新易感基因miR-146a，这是首次鉴定出miRNA分子启动子区域与狼疮疾病发生中发挥重要作用的SNP，对于今后发展miRNA为靶点的干预治疗具有重要意义。系统性红斑狼疮是一种具有极强遗传倾向的系统性自身免疫病，I型干扰素通路过度活化是其重要的分子表型。microRNA（miRNA）在维持免疫系统稳态中发挥重要作用。研究组前期研究发现，miRNA表达或者功能的异常与自身免疫性疾病的发生和发展有关，系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者存在miR-146a表达缺陷，引起I型干扰素通路过度活化，进而参与红斑狼疮疾病的发生发展。研究发现miR-146a启动子区域存在一个重要的SNP与SLE显著相关。携带疾病相关等位基因的个体，其miR-146a基因表达水平显著低于对照组。体外功能研究亦证实，此疾病相关SNP不同的基因型与已被报道的狼疮易感基因ETS1编码表达的蛋白转录因子结合能力不同，增加或者降低ETS-1表达水平可导致miR-146a启动子活性的改变。遗传学分析也证实，ETS1与miR-146a可相互影响，在狼疮发病中发挥叠加效应。二、MicroRNA与肥胖病根据研究显示，两种microRNA分子的上调表达可能是能够导致肥胖和II型糖尿病的胰岛素信号转导功能紊乱的关键。科学家们发现沉默这两种microRNA改善肥胖老鼠的葡萄糖敏感性。这项发现可能会给人类潜在的肥胖治疗指明方向。分子生理学者发现两种microRNA 103 和107在患有脂肪肝病的老鼠和人类体内都上调表达，而脂肪肝病是胰岛素抗性和糖尿病的先兆。三、MicroRNA与帕金森氏症“富含亮氨酸的重复段激酶-2” (LRRK2)所发生的突变已被与家族性和偶发性帕金森氏症联系在一起，但其生化功能却一直不清楚。现在，LRRK2的一个生化功能已被发现。果蝇和人类的LRRK2都被发现拮抗由microRNA调控的对E2F1 和 DP转录因子的翻译抑制。LRRK2与由RNA诱导的沉寂复合物组分Argonaute发生相互作用，来拮抗其对蛋白翻译的抑制效应。活体遗传研究表明，E2F1/DP上调在调控突变体LRRK2的发病机理中扮演一个关键角色。这些发现表明，受损的、由microRNA调控的沉寂作用与特定microRNA目标的失控表达之间有一个联系，它能造成帕金森氏症的发病；而且这些发现还提出了基于microRNA的可能治疗方法。四、MicroRNA与关节炎日本研究人员日前发现microRNA对防止关节炎具有重要作用，有可能催生治疗关节炎和类风湿性关节炎的新方法。研究人员注意到，人类和实验鼠的软骨细胞中富含“miR140”分子，这是一种microRNA，也即长约22个核苷酸的小分子非编码RNA。研究人员通过基因操作，培育出几乎不含“miR140”分子的实验鼠，并人为使它们患上关节炎。结果，与普通实验鼠相比，不含“miR140”分子的实验鼠软骨的损伤程度要严重得多。反之，通过基因操作令实验鼠体内的“miR140”分子增加，那么在同样罹患关节炎的情况下，这些实验鼠软骨的状态则非常良好。研究人员解释说，关节炎主要是构成软骨的蛋白质被称为“ADAMTS5”的酶分解造成的，“miR140”则可以抑制这种酶的活动。研究还发现，体内几乎不含“c”分子的实验鼠，手脚和尾巴都会变短，这证明这种分子对动物骨骼的形成具有重要作用。RNA是遗传信息的载体，和蛋白质的生物合成有密切的关系，而microRNA并不参与蛋白质合成，一直被认为是“无用”的。但是此次研究成果表明，microRNA发挥着其他作用。五、MicroRNA与动脉粥样硬化细胞凋亡除了在发育和体内平衡是具有重要性之外，它还牵涉到许多疾病，其中包括动脉粥样硬化。 凋亡的内皮细胞，在粥样硬化板块处的，会将被称作凋亡小体的微泡释放到循环之中，而其量的丰富程度与疾病的负指征相关。 研究发现，来自内皮细胞的凋亡小体中含有微RNA-126（miR-126），它们会被邻近的血管细胞摄取。 MiR-26增加了来自趋化因子受体CXCR4的信号，而这又触发了自动调节反馈环路，从而导致了CXCL12产生的增加。CXCL12是CXCR4的配基。 CXCL12可限制动脉粥样硬化，而从动脉粥样硬化病人身上分离出的凋亡小体可缩小不同的小鼠动脉粥样硬化模型的粥样斑块的大小。 因此，垂死的内皮细胞会以包裹的微RNA形式向邻近的细胞发出警示信号以触发一个能减少动脉粥样硬化的复原反应。