重组人促红细胞生成素的生产与应用

重组人促红细胞生成素的生产与应用重组人促红细胞生成素的生产与应用编制仅供参考审核批准生效日期地址： 电话：传真: 邮编:重组人促红细胞生成素的生产与应用任雅怡02摘要 重组人促红细胞生成素是成功应用于生物医药领域的重组蛋白药物产品。科研领域对其性质和合成方法已有了成熟的了解。工业生产者也早已开始大量生产重组人促红细胞生成素，并且取得了不俗的市场成效。关键词 重组人促红细胞生成素 生产工艺 应用 市场开发一、 重组人促红细胞生成素的性质促红细胞生成素（erythropoietin,简称EPO）最早于1906年被发现。EPO属唾液糖蛋白激素，由165个氨基酸组成，为人体内源性化合物，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为3436 ku (SDS-PAGE)、 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳），疏水性极强,pI为。它主要来源于肾脏（少量来源于肝脏），由皮质管周围的间质细胞合成。由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30400道尔顿，为含165个氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳动物细胞培养产生，结构与天然EPO极为相似，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体。在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定。1985年，人EPO基因克隆和表达的成功，使rh-EPO的制备成为现实。二、 重组菌构建过程 重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活基本相当。Jacob等人从基因文库中克隆并测序了编码红细胞生成素的DNA片段，同时，以核酸探针从噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Lin等人(1985)由人基因组中获得编码红细胞生成素的基因，将其转入中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中，获得稳定的表达。 Quelle等人利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。虽然经转化的SF9细胞生产的rhEPO的产率有所改善，但是目标产物rhEPO的糖基化程度较天然红细胞生成素为小，因而其分子量亦较小。Mori等人构建了一个含有干扰素-基因启动子的rhEPO表达载体，并利用该rhEPO表达载体转化B细胞白血病BALL-1细胞。经以仙台病毒转染后，转化的B细胞白血病BALL-1细胞比现有技术所得的转化株能产生较高量的rhEPO。重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。至于家蚕体内的表达系统，也存在糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。三、 重组人促红细胞生成素的生产工艺1、 表达红细胞生成素的细胞系构建红细胞生成素表达载体有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。构建表达红细胞生成素的细胞株 以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。将此细胞培养于100 mm培养皿中，待细胞长满至50%60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及lipofectin组成的共转染混合液，37培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。2、 CHO细胞培养工艺过程在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，需要解决的问题就是通过培养而大量生产出目的蛋白。常规动物细胞培养的方法是将细胞放在不同的容器中进行培养。如利用转瓶大量培养贴壁细胞或用生物反应器培养贴壁或悬浮细胞。转瓶培养细胞工艺简单，规模易于扩大，污染易于控制，一直用于疫苗工业的生产，是传统的细胞培养生产工艺。美国Amgen公司是世界上最早获得人红细胞生成素生产和上市的企业，采用的生产工艺即是转瓶培养生产工艺。以下介绍生物反应器培养工艺。种子细胞制备（1）冻存的细胞株37水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。（3）37二氧化碳培养箱培养，连续传三代。（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为106个/ml。 反应器连续培养（1）加入纤维素载体片及的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌小时。（2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM培养基，接种。控制条件，搅拌转速105 IU/mg。四、 重组人促红细胞生成素的应用1、应用情况概述重组人红细胞生成素（rhuEPO）是最早用于临床的重组基因工程药物之一，可促进骨髓内原始血细胞加速分化，促进有核红细胞加快成熟及血红蛋白合成，刺激网织红细胞和成熟红细胞释放，并稳定红细胞膜，提高红细胞膜抗氧化酶功能。rhuEPO最初主要用于治疗慢性肾性贫血，之后随着对众多疾病相关性贫血的病理生理过程以及EPO、铁和红细胞生成三者间相互关系的深入认识，EPO的临床应用逐步扩展。EPO现阶段的临床应用主要有治疗慢性肾病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、肿瘤、充血性心力衰竭、中枢神经系统疾病、认知功能受损、丙型肝炎病毒（HCV）感染等疾病患中、治疗中或恢复期的贫血和组织缺氧症状。2、临床试验效用以下结论来自一些具体相关临床试验的研究文献： rhuEPO明显促进红细胞生成，安全、可靠地改善妊娠期贫血。 大剂量治疗多发性骨髓瘤患者相关性贫血优于数学，其起效快、疗效好，患者生活幸福感改善明显，费用成本低，安全性好。 应用重组人促红细胞生成素可以明显改善肝移植受者术前存在的贫血状态，减少术中异体血液的输注量和术后继续需要输注异体血液的可能。 恶性血液病完全缓解的患者巩固化疗中，应用rhEPO2万U每周1次疗法治疗化疗相关性贫血可以减少输血量和相关治疗费用，并减少输血相关副作用和患者的痛苦。 rhuEPO预处理（皮下注射）能减轻二尖瓣置换术患者的血清心肌酶及肌钙蛋白表达，具有显著的保护心肌作用。 rhEPO治疗能促进新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）患儿神经功能的早期回复，除对红细胞增生有促进作用外，对其他系统无不良反应。 重组人促红细胞生成素不仅能改善慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者的贫血状态，而且可改善患者的营养状况和红细胞免疫功能。 EPO能改善急性病毒性心肌炎临床症状，减轻心肌损伤，降低心律失常、急性左心衰发生率。五、 重组人促红细胞生成素的市场开发状况1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人促红细胞生成素（rhEPO）。自从1989年FDA批准红细胞生成素Amgen公司Epogen、Ortho Biotech公司Procrit 用于临床连续治疗需要透析的慢性肾衰病人以来，很多国家也已经批准红细胞生成素上市和生产，并且市场表现不俗。重组红细胞生成素(EPO)目前的销售额一直排在生物医药类产品的前三名，每年的增长率在10以上。Amgen公司开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp是一种“高糖基化”促红素产品，其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Aranesp2002年全年销售额为亿美元，2003年全年销售额为亿美元,市场前景不可估量。同时，强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素Procrit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额亿美元，2002年销售额亿美元， 2003年销售收入达到亿美元。 2001年，EPO（包括Arnesp）的全球销售额达亿美元，2002年达亿美元，2003年全世界EPO的年销售额超过50亿美元。2005年全球EPO市场比上一年的亿美元增长%，达到120多亿美元，一举成为世界医药市场上首个单品突破百亿美元的药品，从而占据了全球生物基因工程药品的份额的五分之一，创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。 目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生物药业的产品在国内医院的销售额独领风骚，2001年EPO的国内医院销售总额约为47449万元，2002年为49508万元，2003年上半年为28606万元。参考文献【1】 徐志利.重组人促红细胞生成素的制备及临床应用J.药学研究，1993年第2期.【2】 朱绿松，伞德忠，李振武，高晶，候晓薇，彭文广.重组人促红细胞生成素生产工艺研究J.药物研究，2001年第4期.【3】 高云莉.EPO的市场现状及展望J.中国新药杂志，2001年第2期.【4】 刘丽英.重组人促红细胞生成素治疗妊娠期贫血患者的临床观察J.山西医药杂志，2008年11月【5】 李元敏，宋兵，刘瑞生，唐汉博.重组人促红细胞生成素对瓣膜置换术患者心肌保护作用J.临床心血管病杂志，2009年4月.【6】 韩劲草，刘喜林，凌文革. 重组人促红细胞生成素对急性病毒性心肌炎治疗作用的临床观察J.临床急诊杂志，2009年12月.【7】 刘瑜，徐娟，常红，向兵，朱焕玲，徐才刚.大剂量重组人促红细胞生成素在多发性骨髓瘤贫血中的应用J.华西医学，2009年.【8】 孔庆胜，赵守业，杨敏，彭志海. 重组人促红细胞生成素在肝癌行肝移植患者中的应用J.济宁医学院学报，2006年6月.【9】 杨海虹，方平，王春燕，李莹.重组人促红细胞生成素治疗恶性血液病化疗相关性贫血J.中国综合临床，2006年5月.【10】 康文清，朱长连，熊虹，程秀永，王小阳. 重组人促红细胞生成素治疗新生儿缺氧缺血性脑病的疗效J.实用儿科临床杂志，2006年1月.【11】 余尚福，林蔚素，黄德周，丁煦煦. 重组人促红细胞生成素对慢性肾功能衰竭维持性血液透析患者营养状态和红细胞免疫功能的影响J.海峡药学，2009年第4期.