ABI7300的使用维护及校准标准操作程序

ABI 7300的使用维护及校准标准操作程序1、目 的：ABI PRISM 7300型核酸扩增荧光检测仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。2、适用范围：ABI PRISM 7300型核酸扩增荧光检测仪。3、操作人：段建平 蔡果4、操作程序4.1操作方法4.1开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开ABI7300系统软件，进行实验。4.2 创建荧光定量PCR检测文件： 双击7300 System Software 软件图标。从File菜单中选择New（或单击工具栏中的“新建”按扭） 在New Document窗口中，Assay项选择“Absolute Quantification(Standard Curve)”，选择“完成”，就会出现一个96孔的空白面板。 双击此空白面板中的任一方格，就会弹出“Well Inspector” 。 在“Well Inspector”窗口单击“Add Detector”就会弹出“detector manager” 窗口。点击“File New.”，就会弹出“new detector”菜单 在“new detector”窗口进行样本信息输入：1）在“Name”可以输入：HBV_20060101按自己的喜好输入易于区分的name。2）在“Reporter Dye”选择所用试剂探针所采用的报告基团如：FAM3）在“Quencher Dye” 选择所用试剂探针所采用的报告基团如：TAMRA4）在“Color”点击右边颜色小方格后可以按自己的喜好选择颜色。 5）设置好之后点击OK会回到“detector manager” 窗口在“detector manager” 窗口依次点击“Add To Plate Document” 、“Done”。 完成了Detector的设置；会重新回到“Well Inspector”菜单,请做如下设置：1）在“Passive Reference”选折None；2）在“Use”下的小方框中打勾；3)在“Sample Name”一般在参考标准品反应孔中习惯性的输入：试剂批次号如：HBV2006018。设置好之后关闭“Well Inspector”菜单。4.3 设置循环条件：在Plate面板中选中“Instrument”，通过面板上的“Add Cycle”、“Add Step”、“Data Collection”等按钮，参照试剂说明书设置好“Instrument”面板。选择 File （文件） Save As （另存为），为绝对定量反应板文件输入一个文件名，然后单击 Save （保存）。4.4推开滑门，按照面板设置放好自己的试验样品，关闭仓门。4.5按下Start开始PCR实验。在仪器运行 PCR 程序期间， Instrument （仪器）选项卡上会显示实时状态信息，并报告荧光信号强度。程序运行结束后，状态值和按钮变为灰色，而且 Analysis （分析）按钮 ( ) 变为可用状态，并显示信息提示您程序是否成功运行。程序运行期间生成的所有数据都保存到步骤 中指定的绝对定量反应板文件中。4.6在反应结束后按Save键储存实验结果，关闭扩增仪电源开关。4.7实验结果分析。试验结束，为保险起见，可再次保存试验结果到指定目录，然后打开试验结果*.sds文件点击“result”下有“Plate、Spectra、Component、Amplification Plot、Standard Curve、Dissociation、Dissociation、Report”7个子目录。一般我们用“Amplification Plot”项来观察每孔的扩增实时曲线 “Amplification Plot”项的曲线有“log值”和“求导后的线性值”的2种表现形式，通过“ToolGraph Settings.”或通过鼠标左键双击非曲线区依次选击“linear”“OK”将“log值”转换到“线性值”曲线。您可以通过点击每个孔来观察所对应的扩增的曲线来判断该孔的结果。一般：依次看：“N”“4S”(并设置好T值 和 基线 )【定量：是指通过已知的标准参考品来判定未知】设置好T值和基线后，然后选中“N4S”按住键盘Ctrl不放手，依次 点击 / 再点击 某未知样品孔来判定该孔样品的扩增曲线，并结合“Plate”、“Report”子目录 来定量该孔样品的Qty值。4.2维护方法微软件Windows NT工作站的维护硬盘驱动器每月29日左右运动一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或类似软件。具体步骤：a) 放入Norton Utilities 光盘。b) My Computer打开Norton Utilities软件光盘。c) 启动清理碎片/优化程序。d) 运行完成后，检查以确信无严重错误记录，退出Norton Utilities。e) 取出Noton Utilities光盘，重新启动计算机。CR仪的维护.1样品槽的清洁样品槽每月29日左右进行一次清洁，如出现样品槽污染情况则随时清洁。操作方法：a) 确定污染物的来源和位置:用少量的去离子水,清洁样本块中包含污染物的反应孔.b) 执行背景校正后,还是发现有些孔中还有污染物时用少量95%EtOH溶液,清洁样本块中包含污染物的反应孔.c) 执行背景校正后,还是发现有些孔中还有污染物时用少量10%漂白溶液, 清洁样本块中包含污染物的反应孔,直至污染物去掉d) 如果依然存在污染物,请与美国应用生物系统公司技术支持联系.4.2.3 ABI PRISM 7300光路系统的维护.2调准ROI参照条调准ROI参照条在仪器更换卤素灯、仪器定期校准或仪器维修后进行。不得由一般实验人员进行该项操作。a) PCR仪样品槽中放入荧光检测板。b) 将ABI PRISM 7300光源检测器向前拖动盖信样品槽，并旋紧。c) 从Start菜单选择运行 ABI PRISM 7300SDS管理软件。d) 积分时间从1024ms开始，用位置调整后，调节ROI的高度与右边线。e) 逐渐增加积分时间，直到可以看到至少四个块（约4096ms）通过。f) 调整最左侧位置调整点。g) 减少积发时间到2048ms，调整上方与底部的位置调整点。h) 减少积分时间以便最右侧块可见但未饱和（约1024ms），调节最右侧位置调整点。如有需要用右上角拖动点调整图像的倾斜度（以左上角为中心旋转）。i) 调节后的参照条宽度必须在ROI参照块间有小空隙。.2校正ROI光路ROI光路校正每月29日左右进行一次，以便确信结果仍然是优化的。a) 在PCR仪样品槽中放入荧光检测板。b) 将ABI PRISM 7300光源检测器向前拖动盖住样品槽，并旋紧。c) 从Start 菜单选择运行ABI PRISM 7300 SDS管理软件。d) 点选Show ROI复选框。每个样品也周围出现一蓝色椭圆圈。e) 点选Show Saturation复选框。f) 设定积分时间为1024ms；打开卤素灯和光闸。g) 点击LIVE按钮获取图像，然后在任何地方左击停止。获取中等程度未饱和图像（无红色图像）。h) 从Edit菜单中选择Calibrate POIs每个孔选取合适的ROI，确定96孔都被蓝色椭圆圈正确界定。i) 图像太亮太暗都会出现错误信息，相应增加或减少积分时间，并重复上述第8步直到无错误信息出现。j) 检查也ROI集团，所有孔住处都应包含在96个ROI椭圆圈中。如果没有，重复8和9步。.3检查PCR仪样品槽的荧光污染检查PCR仪样品槽的荧光污染每月5日进行一次，如有需要随时进行。a) 开启ABI PRISM 7300型核酸扩增荧光检测信电源。b) 从Start菜单选择运行ABI PRISM 7300 SDS管理软件。c) 从样品槽中移去反应板。d) 将ABI PRISM 7300光源检测器向前拖动盖住样品槽，并旋紧。e) 设定积分时间为1024ms;打开卤素灯和光闸。f) 点击LIVE按钮获取图像，然后在任何地方左击停止。g) 观察96孔中背景荧光，如孔有显著荧光则表示该孔存在荧光污染。h) 按照样品槽的清洁程序清洗样品槽。.4更换卤素灯仪器使用大约2000小时后应更换卤素灯，但具体要示卤素灯实际情况而定。a) 关闭ABI PRISM 7300型核酸扩增荧光检测仪，冷却15分钟。b) 移去ABI PRISM 7300光源检测器顶盖。c) 移去卤素灯顶盖。d) 把旧灯泡从插座中滑出，更换新卤素灯。确信灯正确安装在位置上。滑动灯泡时要轻轻抬起灯以避开装配螺丝钉。重新装上灯顶盖和ABI PRISM 7300光源检测器顶盖。e) 开启ABI PRISM 7300型核酸扩增荧光检测仪电源，运行ABI PRISM 7300 SDS管理软件。f) 通过软件控制卤素灯开关，确认灯随开关开闭。g) 开启光闸，确认光闸可打开。h) 设定积分时间为1024ms，点击LIVE。保证要以采集一幅数据图像。i) 若新卤素灯不工作，ABI PRISM 7300电源保险管可能有问题。j) 也可以用自动调节光源.424、校准：ABI7300基因扩增检测仪校准工作需由专业工程师进行，每年校正一次，另外以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。通过对室内质控图的分析，及时发现系统误差的出现。经过分析排除了试剂和人员误差后，应进行仪器状态校验实验：424.1 使用标准化试剂作为校验试剂，分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。424.2 每年10月由固定人员进行上述实验，仪器若搬动或配套仪器（如UPS等）的变动亦需进行上述实验，观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围和103标准品是否检出。424.3 当103标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时，先排除实验的人员、试剂因素，再重复实验。如结果依然，联系厂家进行仪器校准。424.4 当仅有103标准品未检出时，检查实验全过程。再次上机检测103标准品两枚。如仍未检出，则联系厂家进行仪器校准。424.5仪器经过校准后，重复该实验，结果归入仪器档案。注意事项：a) 仪器应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有良好的接地线。b) 环境温度保持在23左右，湿度保持在60%c) 仪器应配备功率3000w的稳压器。d) 仪器应定期清洁维护。e) 仪器使用时应严格遵守上述使用步骤。5、扩增分析程序5.1核酸扩增标准程序扩增反应前须先在ABI PRISM 7300职SDS软件的设置面板上按照事先排好的标本位置进行设置。每次实验除了待检标本，还要包括一个阴性对照、一个阳性对照、一个阳性室内质控品、一组阳性标准品（4个梯度107、106、105、104）。依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows NT界面。接关打开光源检测器和PCR仪电源开关，预热5分钟。击ABI PRISM 7300 SDS图标，打开软件。在New plate Application窗口分别选定ABI PRISM 7300/SYBR Green，然后单击OK，打开一空白设置面板。在Setup版面设定样品种类与名称，数量。a) 在Type栏中选择类别：STND-标准梯度，UNKN-未知样品， NTC-阴性对照，Not in use 未使用。b) 再在Name栏中依次输入样品名称c) 在框定所选标准梯度孔数后，需在工具栏中单击P窗口，选定PR1 Primer SYBR后，关闭窗口，可见所选孔左下角有一长方形阴影。d) 在框定所选孔数后，在工具栏中单击Q窗口，即可在此窗口输入定值标准品的标准量。点击Instrument即可在此窗口设定循环参数。选取定任务栏File中的Save项，弹出对话框。在对话框中的File Name项下输入一组数字和（或）字母组成的文件名，选Save.检查设置正确与否。运行程序：a) 在设置完程序文件Instrument 窗口，点RUN键，即可运行。b) 反应结束后，选任务栏File中的Save项，保存实验结果。5.2结果分析标准程序对于ABI PRISM 7300结果曲线的分析，应按以下步骤进行：全部曲线阴性对照阳性对照阳性室内质控品阳性标准品逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果登记，发报告。整体曲线的观察将所有曲线选中进行整体观察a) 观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一Ct值出现上涨的情况。b) 观察是否有光跑传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。阴性对照的分析阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。阳性室内质控品的分析阳性室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知和未知浓度的阳性室内质控血清。作用：用以监控日常实验的精密度。阳性标准品的分析a) 各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳模稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为误差。b) 观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置。情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct值均后移，则判断是否为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。c) 每日必估103标准品，用作以下三方面监控：一是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致103标准品未能检出；二是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况；三是若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况A、V，则判断是否为试剂灵敏度下降。单个曲线的判断逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲经。（可疑标本是指曲线在27个Ct值后出现上小组长且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。）曲线观察内容：在基线选择 2-8时观察Rn值大小（是否有三期特征）。在基线选择0-0时观察Rn值曲线形状。得出定量结果调节基线和阈值以得到一较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时就排队某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。发放报告及时登记检测结果记录，发放临床报告。