HPLC分析方法的建立与开发.ppt

建立分析方法 色谱分离度与分离性能 HPLC分离的机理 分离是一 个物理的 过程。 色谱工作者关心的基本问题 - 色谱峰之间的分离度 to tRA mAU time tRB R = 分离度 tRA = 组分 A的保留时间 tRB= 组分 B的保留时间 w = 峰的基线宽度 w1/2=半峰宽 )( )(2 BA RR WW ttR AB )( )(1 7 6.1 2121 B AB WW ttR A RR 分离度值 等梯度洗脱的基本分离度公式 N: 总的理论塔板数 ; 柱效 k: 容量因子 (保留因子 ), 色谱峰的保留作用 ： 色谱峰的相对分离程度 ; 选择性作用 影响分离度的因素 容量因子对分离度的影响 容量因子 - 流动相组成的影响 选择性 影响选择性的参数 降低 增加 较弱的溶剂 较强的溶剂 异丙醇 /水 甲醇 /水 乙腈 /水 C-2 C-18 容易超 载 不容易超载 改变流动相组成 改变固定相 有机成分含量低的固定相 有机成分含量高的固定相 色谱柱温度对分离度的影响 柱效 计算柱效 典型的流速值 4.6 1-2 3.0 0.4-0.8 2.1 0.2-0.4 1.0 0.05-0.09 柱内径 mm(5um 粒度 ) mL/min flow rate2 = i.d.2 i.d. 1 2 flow rate1 柱外体积的影响 10 L 20 L Time, min. 2.1 x 150 mm F = 0.2 mL / min. 样品体积 连接管路的体积 检测器体积 检测器电子线路的时间常数 所需分离度与柱长匹配 峰对称性 提高分离度 增大 k 增加选择性 提高柱效 分离度与 k, n 和 的关系 液相色谱流动相及固定相 流动相 与 GC流动相不同 ， HPLC流动相为溶剂 ， 它既有 运载作用 ， 又和固定相一起参予对组分的竞争 ， 因 此溶剂的选择对分离十分重要 。 1、 理想的溶剂应有下列特性 1） 化学稳定性好 ， 与固定相不互溶 、 不发生反应 2） 必须和检测器相适应 使用 UV检测器时 ， 溶剂截止波长要小于测量波长 使用折光率检测器 ， 溶剂的折光率要与待测物的折 光率有较大差别 3） 对待测物具一定极性和选择性 4） 高纯度 。 否则基线不稳或产生杂峰 ， 同时可使截 止波长增加； 尽量避免使用有显著毒性的溶剂 5） 适宜的粘度 粘度过高 ， 柱压增加 过低 （ 例： 戊烷 、 乙醚等 ） ， 易产生气泡 2、溶剂的极性 溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大， 表示溶剂的洗脱能力越大。 序号 溶剂 紫外波长极限 （ nm） 序号 溶剂 紫外波长极限 （ nm） 1 异辛烷 197 9 氯仿 245 2 正己烷 190 10 二氧六环 215 3 甲基叔丁基醚 210 11 丙酮 330 4 苯 278 12 乙醇 210 5 二氯甲烷 233 13 醋酸 6 正丙醇 240 14 乙腈 190 7 四氢呋喃 212 15 甲醇 205 8 乙酸乙酯 256 16 水 200 3、流动相的选择 4、梯度洗脱 特点：可以缩短总的 色谱周期，提高分离效 能，改善峰形，减少拖 尾，可以增加灵敏度， 会引起基线漂移 固定相 化学键合固定相 方法 ：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成 柱填 （ 约有 3/4以上分离问题是在化学键合固定相上进行 ） 特点： 稳定 、 流失小 、 适于梯度淋洗 分离机理： 兼有吸附 、 分配两种分离模式 。 化学键合 的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用 。 对多数键 合相来说 ， 以分配机理为主 。 载体 主要是硅胶 （ 表面有硅醇基 ） ,特点为： 可以制备成粒度分布窄的多种粒度 机械强度好 ， 可以填充成稳定 、 高效的填充床 长期高压操作下不变形 反压较低 、 柱寿命长 较其它材料制成的柱有更高的柱效 适用于小分子 、 大分子的分析和制备 高 pH值下会分解 （ pH 8） 键合方法： （ l） 硅酯化 （ Si-O-R） 键合固定相 （ 2)硅氮型 （ =Si-N=） 共价键合固定相 （ 3） 硅烷化 （ Si-O-Si-R） 键合固定相 使用键合固定相应注意的问题 硅胶键合相的稳定性 键合相色谱分离的重现性 键合相色谱分离的选择性 键合相色谱柱的再生 化学键合相色谱法 正相色谱和反相色谱 反相色谱的定义： 在非极性的固定相上，用极性较大 的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反 相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性 正相色谱的定义： 在极性的固定相上，用极性较小的 液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相 色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性 正相色谱和反相色谱 正相色谱和反相色谱的差别： 正相色谱 反相色谱 固定相极性 大 小 流动相极性 小至中等 中至大 组分流出顺序 极性小的组分先流 出 极性大的组分先流 出 流动相极性增大 保留时间变小 保留时间变大 分离组分 油溶性或水溶性的 极性和强极性化合 物 非极性、极性或离 子型化合物 正相色谱 低极性流动相 反相色谱 高极性流动相 中等极性流动相 中等极性流动相 时间 时间 时间 时间 待测物极性： ABC 正、反相色谱中极性和保留时间的关系 正相键合相色谱法 固定相： 正相色谱中采用 极性 键合固定相，是 把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活 化处理制成表面含有大量 硅羟基 的载体后， 再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反 应，生成表面具有 胺基、腈基、醚基 的极性 固定相。 流动相 ： 在非极性或极性小的溶剂 （ 如烃类 ） 中加入适 量的极性溶剂 （ 如氯仿 、 醇 、 乙腈等 ） ， 分离极 性化合物 。 此时 ， 组分的分配比 k值随其极性的 增加而增大 ， 但随流动相极性的增加而降低 。 主要用于分离 异构体 、 极性不同 的化合物 ， 特 别适用于分离 不同类型的化合物 。 反相键合相色谱法 采用 非极性键 合固定相 ,是把全多孔 (或薄壳 ) 微粒硅胶载体 ,经酸活化处理后 ,和含有 烷基链 或苯基 的硅烷化试剂反应 ,生成表面具有烷基 ( 或苯基 )的非极性固定相，如 C18、 C8 流动相： 流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、 水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃 等低极性化合物 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相 ，可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一 些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等 具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点 硅胶 -烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响 时间， min 固定相： C1 固定相： C8 固定相： C18 1-尿嘧啶； 2-苯酚； 3-乙酰苯； 4-硝基苯； 5-苯甲酸甲酯； 6-甲苯 可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。 分析方法建立 分析时要了解的情况 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品 的分析方法 查文献和方法，如 CA,AA,AOAC,EPA- 仪器制造商的文献 充分了解自己的样品 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 分析时要了解的情况（续 1） 灵敏度的要求有多高 ? 样品的本底是否很复杂 ? 有多少组份要分析 ? 对分析的精确度、准确度等有多高要求 ? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用 ? 分离 (制备 )时要了解的情况 要分离（即制备）的样品量有多大 ? 要分离的组份在样品中的含量很高 ? 还是微量 ? 是否需要保持生物活性 ? 对分离产物纯度的要求有多高 ? 纯度或活性的鉴定如何完成 ? 什么化合物参数能用于分离 ? 分子量不同 /MW 2000 凝胶渗透 / 凝胶过滤 离子化分子 离子对 / 离子交换 极性不同 吸附 / 反相色谱 同系物 / 苯系物 反相 中性、酸和碱的混合物 反相 生物分子 亲和 /HIC/凝胶过滤 /反相 立体异构体 吸附 手性化合物 手性色谱 结构数据 数据收集 固定相和流动相选择 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节 k 值改变保留值 调节 值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度 记住 每次改变一个参数 使用文献方法注意点 色谱柱填料的种类、品牌是否相同 ? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱 ? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速 长度内径， 进样量 初始初始 现在现在 初始 LD LD LD L oadL oad 2 2 )( )( )( 内径 流速 初始 现在 初始 D D D FF 2 2 )( )( )( 常规样品分离的系统方法 总的指导原则 改变可以明显改善选择性的条件 避免会影响方法普适性的实际问题 减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟 选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样 的方法建立未知样品（离子的或中性）的 HPLC 分析方法 先做简单易行的 实验（改变色谱柱、改变 pH、 使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件） 反相 HPLC分离的总体方案设计 1、确定样品是属于常规的还是特殊的 特殊样品包括： 无机离子 对映体 生物分子 合成的高分子 碳水化合物 异构体 2、选择分离条件，进行第一次分离 分离变量 最佳的初始选择 柱填料 C8 或 C18 柱结构 15cm*4.6 mm 或 25cm*4.6 mm， 5 m 流速 1.0 ml/min（或 2.0 ml/min） 流动相 乙腈 水（中性样品） 乙腈 -缓冲液（离子型样品）（缓冲液为 25- 50mM磷酸缓冲液， pH 2 3） 对初始试验： 5 100%B 梯度 温度 常温 进样量 50 L（ 20 L ） 选择流动相 在反相色谱中常用水 /乙腈 pH的选择思路 选低 pH可以使柱硅羟基质子化并 降低其色谱活性 低 pH与常见酸碱官能团的 pKa值 相差较远，组分在此条件下的 tR受 pH变化影响小 初期应 避免使用 三乙胺和离子对 试剂等添加剂 准备标准样品 过滤样品 安装色谱柱 冲洗柱，平衡 平衡检测器 进样 分析结果 第一次 HPLC 运行 第一次 HPLC 运行 选择逐步方法开发步骤 用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降 低洗脱液强度 尝试运行梯度 第一次 HPLC 运行 无峰 /响应 分离度差的峰 第一次运行得到的结果可能 : 检测方法不正确 浓度太稀 提高进样浓度，或者在无色 谱柱的条件下注射少量样品 改变流动相 优化系统 得到了色谱峰 - 是 - 否 检查 HPLC系统 3、做初次运行并根据谱图将样品分类 0.5k20 等度洗脱可行，超出此范围 等度洗脱可行的样品 建议用梯度洗脱的样品 反相保留太弱的样品 改变 pH、加入离子对试剂、改变 柱子、改用正相色谱 强保留样品 用非水反相或正相条件 复杂样品 4、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等 度运行的最佳 B% 5、评价第二次运行中峰的质量 -柱效、峰宽、峰形 峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、 pH、添加剂等） 运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复 的保留时间 6、 对等度方法，可以改变 ACN%来改善峰间距和 分离度 若有必要， ACN改为 MeOH，并根据峰间距和 分离度优化 MeOH% 可以进一步混合 ACN和 MeOH成为三元溶剂系 统，并优化 7、若 6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择 性和分离的附加条件 8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰 间距和分离度 结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型 分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附 加条件 9、对梯度方法，改变初始和最后的 B%、梯度变化速 度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间 10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流 速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间 等度分离方法 反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件 色谱柱： C18， 4.6mm 15cm 流动相：乙腈 /水，不同的溶剂强度， 60/40、 50/50、 40/60，由强渐弱 （或走梯度） 流速： 1ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯 (Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯 (Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯 (Butyl Paraben) 改变容量因子 K 60/40 50/50 40/60 (改变比例 ) 对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸丙酯 对羟基苯甲酸丁酯 通过改变 流动相比例 改变选择性 改变选择性 通过改变 流动相组成 改变选择性 同样强度的不同溶剂 62:38/ 42:58/ 72:28/ 23 2 2 ， ， ， OHCNCH OHM e O H OHT H F 固定相优化：改变色谱柱 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 4 5 6 7 8 9 10 3 C-18 C-8 Optimization 10种巴比妥药物的分离（等梯度） 保留时间 (min) 3.14 相对吸光度 4.55 5.74 6.44 7.1 1 7.74 10.76 11.79 12.63 1 巴比妥 2 阿洛巴比妥 3 阿普比妥 4 苯巴比妥 5 异丁比妥 6 环戊巴比妥 7 布他比妥 8 海索比妥 9 异戊巴比妥 10 甲苯比妥 25% 乙腈 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3 13 优化流动相 - 困难的分离 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 0 20 10 40 30 50 60 70 80 90 100 乙腈 /水 甲醇 / 水 四氢呋喃 /水 甲醇 1 4 6 7 2 5 3 四氢 呋喃 乙腈 1.从甲醇 /水开始，优化溶剂组成 以使所有色谱峰在合理的 k 范围 流出 . 2.选择洗脱强度相等的乙腈 /水混 合流动相进行下一次分析 . 3.用四氢呋喃 /水流动相重复分析 4.按比例混合等强度流动相再进行 进样分析 优化 三种流动相的比较 1 巴比妥 1 1 1 1.8 1.6 1.6 2 阿洛巴比妥 2 2 2 1.2 1.1 1.1 3 阿普比妥 3 4 4 1.1 1.1 1.1 4 苯巴比妥 4 3 3 1.2 1.4 1.3 5 异丁比妥 5 5 5 1.1 1 1 6 话环戊巴比妥 6 6 6 1.1 1.1 1.1 7 布他比妥 7 7 9 1.5 1.2 1.1 8 海索比妥 8 9 7 1.1 1 1.1 9 异戊巴比妥 9 10 10 1.1 1.4 1.8 10 甲苯比妥 10 8 8 25% 乙腈 35% 甲醇 21% 异丙醇 洗脱顺序 选择性 离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱 离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 通过改变流动相的 pH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的 pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的 pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质 C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的 pH在 2-8内 如果： 一些酸在 pH低于 2时还保持离子化 一些碱在 pH高于 7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物反相柱，在 pH高于 7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法” 分离弱离子化化合物的初始实验条件 水相缓冲液 /乙腈 可变 (k = 0.5 20) 分离变量 初始选择 尺寸 粒度 键合相 15 (或 25) x 0.46 cm 5 或 3.5 m C18 或 C8 溶剂 A 和 B（ % B） 温度 体积 质量 40 C 20 L 1.5的 条件下，柱效的 变化对采用峰面 积定量的定量分 析结果没有影响 ，而对使用峰高 定量的定量分析 结果有影响 。 如其他因素不变，如： K ， ， 流速等，柱效增加 峰面积基本不变，而峰高 增加 6 2 4 1 . 0 1 . 1 1 . 2 2 3 1 液相色谱流动相的 组成变化，如采用梯 度洗脱时，固定相、 洗脱液和待测组分之 间的平衡很难保持一 致，洗脱时基线也常 出现漂移使峰面积、 峰高测量产生误差。 样 品15 l对二甲氧基苯 色谱柱Resolve Silica 溶 剂二氯甲烷/戊烷 从85:75到60:45 k =3.0 k =1.9 k =4.9 k =1.5 4、检测器特性 检测器工作的稳定性和线性范围直接影响色谱定量 分析结果的准确性和重复性。 5、分离度 分离度的大小直接影响峰面积和峰高的计算准确 度，进而影响色谱定量分析的准确度 。 （四）定量分析的误差来源和校正方法 色谱定量分析中的每一步操作过程都会带入误 差，最后定量分析结果的误差则是前面每一步误差 的总合。 1、系统误差 （ 1）样品制备过程中待测组分的损失 溶解是否完全、浓缩和预分离时是否有挥发、萃 取和沉淀是否完全等 （ 2）色谱仪进样分流比、衰减比不正确或线性响应 范围窄 进样分流比不正确造成进样量误差； 衰减比（记录仪）不正确造成峰面积测量误差； 线性范围过窄，引起进样量不当， 响应值超过线性范围，出现计算误差 （ 3）由不正确的标准校正曲线 和校正因子引起 曲线 A：因在零浓度时仍有 色谱峰，可能有杂质未分开 曲线 B：在此浓度内，检测 器的响应值是非线性的 曲线 C：可接受的理想状态 曲线 D：表明有样品的损失 ，可能是色谱柱的非特征吸 附，也 可能是样品制备时的 损失 A B C D （ 4）测量者不良习惯和偏向引起 由 (1)、 (2)、 (4)产生的系统误差在色谱定量分 析中可采用内标法或标准加入法加以校正，由（ 3 ）产生的系统误差只能使用已知准确含量的标准 样品进行校正。 2、随机误差 色谱定量分析中的随机误差是指那些原因无法查 明、大小随机涨落而且不可避免的误差 3.过失误差 主要是由操作者工作中的马虎和操作的错误引 起的。如：称量错误；样品处理时带入的组分损 失和污染；读数错误；仪器操作误差；计算错误 等。