《荧光分析法》PPT课件.ppt

荧光分析法 （ fluorescence) 荧光棒发光原理 荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧 化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发 光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反 应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目 前市场上常见的荧光棒中通常放臵了一个玻璃管夹层， 夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓， 两种化合物反应使得荧光染料发光。 荧光分析法 荧光： 物质分子接受光子能量被激发后，从第 一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射 出的光。 优点： 灵敏度高；选择性好；试样量少；方法 简单。 缺点： 应用范围小。 荧光分析法： 根据物质的荧光谱线位臵及其强 度进行物质鉴定和含量测定的方法。 第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 基态 单重态 S 三重态 T E isS 12 sM 单重态： s=0， M=1， 分子所处的电子能态。 分子的多重性： 总自旋量子数： 三重态： s=1， M=3， 分子所处的电子能态。 1.分子的电子能级与激发过程 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通 过辐射跃迁 (发光 )和无辐射跃迁等方式失去能量。 2.荧光的产生 传递途径 辐射跃迁 荧光 振动弛豫 无辐射跃迁 磷光 系间跨越 内转换 外转换 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l 2 T2 内转换 振动弛豫 非辐射能量传递过程 振动弛豫 (vibrational relexation)： 出于激发态各振 动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子返回到同一电子能级的最 低振动能级间的过程；发生振动弛豫的时间 10 -12s。 内部能量转换 (internal conversion)： 当两个电子激 发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时， 受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子 能级的过程。 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l 2 T2 内转换 振动弛豫 外部能量转换 （ external conversion)： 激发态 分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而失去能量 的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “ 猝灭 ” 。 体系间跨越 (intersystem crossing)： 处于激发态 分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化 的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。 非辐射能量传递过程 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l 2 T2 内转换 振动弛豫 辐射能量传递过程 荧光发射： 激发分子从 第一激发单重态的最低振 动能级 跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐 射称为 荧光 ；荧光辐射能要比激发能量低，荧光 波长大于激发波长；荧光发射时间为 10-9-10-7s。 磷光发射： 激发分子由 第一激发三重态的最低振动 能级 跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为 磷光 ； 磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为 10-4-10s。 S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间跨越 内转换 振动弛豫 能 量 l 2 l 1 l 3 外转换 l 2 T2 内转换 振动弛豫 荧光分光光度计的主要部件： 光源、激发单色器、 发射单色器、样品池、检测系统。 光源 激发单色器 样品池 发 射 单 色 器 检测器 放大器 指示器 记录器 SK-2003A型荧光光谱仪 (国内首创） RF-5400荧光光度计 Hitachi(日立 )F-2500荧光分光光度 荧光分光光度计澳大利亚 （二）荧光的激发光谱和发射光谱 激发光谱 （ excitation spectrum） ：将激发光的光 源用激发单色器分光，使不同波长的入射光激发 荧光体，然后让所产生的荧光通过 固定波长的发 射单色器 而照到检测器上，测定不同波长光照射 下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光 强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。 注意： 激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光 谱曲线是 荧光强度与波长的关系曲线 ，吸收曲线则 是 吸光度与波长的关系曲线 ，两者性质是不同的。 荧光光谱（ fluorecence spectrum）： 固定激发 光波长为最大激发波长 ，而让荧光物质发射的 荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长 下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强 度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。 荧光物质的最大激发波长（ lex）和最大 发射波长 （ lem） 是鉴定物质的根据；也是定 量测定最为灵敏的条件。 荧光光谱的普遍特性 1.斯托克斯位移 (Stokes shift): 激发光谱与发射光谱之间的波长差值 ；荧光发 射波长总是大于激发光谱波长。 室温下菲的乙醇溶液荧光光谱 2.荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长 的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单 重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光 发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状 与激发波长无关。 3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系 荧光光谱的普遍特性 激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。 nm 200 280 360 440 520 0 20 40 60 80 100 F a b4 b3 b2 b1 b0 c0 c1 c2 c3 c4 蒽的激发光谱（虚线） 荧光光谱（实线） 蒽的能级跃迁 V=0 V=1 V=2 V=3 V=4 V=0 V=1 V=2 V=3 V=4 b4 b3 b2 b1 b0 c0 c1 c2 c3 c4 E4 E3 E2 E1 E4 E3 E2 E1 0S 1S 荧光猝灭： 荧光物质分子与溶剂分子或其他 溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现 象称为荧光猝灭。 荧光熄灭剂： 能引起荧光强度降低的物质。 4.荧光熄灭剂 荧光熄灭法 : 荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧 光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系， 可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄 灭法。 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 物质产生荧光必须具备的条件： （ 1）物质的 分子必须具有能够吸收紫外和较短 波长可见光的结构 ; （ 2） 只有那些具有 p- p共轭双键的分子才能发 射较强的荧光 . 二、荧光与分子结构 1.长共轭结构（芳香族化合物） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移 eml f 205nm 278nm 286nm 321nm 356nm 404nm 0.11 0.29 0.36 exl 2.分子的刚性 分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰 撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧 光长移。 2.0 f 0.1f 3.取代基对分子发射荧光的影响 （苯环上）取代 给电子基团，使 p 共轭程度升高。荧光强 度增加：如 CH3， NH2 ， OH ， OR等。 (苯环上）取代吸电子基团时，荧光强度减弱甚至熄灭： 如： ， COOH ， CHO， NO2 ， N=N。 高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚 至熄灭。如： Br， I 。 1.分子荧光分析中，含有重原子如碘、溴的分子易发生： ( ) A 振动弛豫 B 内部转换 C 体系间跨跃 D 荧光发射 答案： C 2.在下列的四种说法中，哪一种是不正确的（） A分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系； B分子荧光发射光谱形状与激发波长没有关系； C分子荧光发射光谱与激发波长不同而变化； D分子荧光发射的强度与激发光的强度成正比的关系。 答案： C .下列说法正确的是 ( ) A 分子的刚性平面有利于荧光的产生 B 磷光辐射的波长比荧光短 C 磷光比荧光的寿命短 D 荧光猝灭是指荧光完全消失 答案： A