《致泻性大肠杆菌》PPT课件.ppt

致泻性大肠杆菌检验技术 河北省疾病预防控制中心 细菌寄生虫病防治与消毒所 甄素娟 概 念 大肠杆菌的部分血清型可引起肠道感染， 称为致泻性大肠杆菌 致泻性大肠杆菌按照毒力因子、致病机理 和流行病学特征分为 5类 肠致病性大肠杆菌（ EPEC） 肠侵袭性大肠杆菌（ EIEC） 肠产毒性大肠杆菌（ ETEC） 肠出血性大肠杆菌（ EHEC） 肠聚集性粘附大肠杆菌（ EAggEC） 生物学性状 形态 大肠杆菌是革兰氏阴性短杆 菌，大小为 1.0 1.5m 2.0 6.0m 多有鞭毛，约为 4 6根， 为 周毛菌。没鞭毛的细菌也可 使人或动物致病 大肠杆菌具有菌毛，分为性 菌毛、普通菌毛和与致病性 有关的菌毛。与细菌致病性 有关的菌毛有： K88、 K99、 987P、 CFA 、 F41 CFA 等 培养特性 大肠杆菌在普通营养琼脂上生长良好，最 适生长温度为 37 ， 42 44 仍能生长。 兼性厌氧菌，氧气充足生长较好。 最适生长 pH为 6.8 8.0，低于 6.0或高于 8.0 生长缓慢。 在普通培养基上的菌落形态 光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿 润、光滑，呈灰色，在生理盐水中容易分 散。 粗造型：菌落扁平，边缘不整齐，易在生 理盐水中自凝。 粘液型：常为含有荚膜的菌株。 生化特征 -1 分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、 甘露醇、木糖、阿拉伯糖等多 种糖类，产酸产气。 在肠道鉴别培养基上形成有色 菌落。 吲哚试验、甲基红试验阳性； V-P试验阴性；不能利用柠檬 酸盐作为碳源；分解葡萄糖铵 盐；不分解尿素；明胶液化阴 性；不分解侧金盏花醇；在氯 化钾培养基上不生长。 生化特征 -2 EIEC：不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，除 O124 外无动力；乳糖、蔗糖不产酸或产酸，葡萄糖产 酸产气或不产气， H2S阴性，靛基质阳性，酒石酸 盐阴性，赖氨酸脱羧酶阴性。 O157： H7大肠杆菌不发酵山梨醇或迟缓发酵，在 CT-SMAC平板上菌落为白色；绝大多数不具有葡 萄糖醛酸酶，不能水解 4-甲基伞形花内酯 -D葡 萄糖酸苷，不能产生荧光；绝大多数 EHEC发酵 棉子糖、卫矛醇，能够利用鸟氨酸赖氨酸，其他 大肠杆菌中 20%左右发酵棉子糖， 50%左右发酵卫 矛醇，有部分大肠杆菌不能利用鸟氨酸赖氨酸。 抗原结构 大肠杆菌的表面抗原包括菌体 抗原（ O抗原）、鞭毛抗原 （ H抗原）、荚膜抗原（ K抗 原） O抗原即细胞壁外膜上的脂多 糖（ LPS），目前已发现 O抗 原有 170多个血清型， H抗原有 55种左右。 最初分离的菌株动力往往较差， 与 H抗血清的反映凝集差，需 在半固体培养基上传代以利于 鞭毛的生长。 致病物质与所致疾病 在肠道内一般不致病，但如果移位侵入肠 道外的组织或器官可引起肠外感染，以化 脓性炎症最为多见。 引起泌尿系统感染的大肠杆菌称为泌尿道 致病性大肠杆菌（ UPEC），引起尿道炎、 膀胱炎、肾盂肾炎。 一些大肠杆菌还引起腹膜炎、胆囊炎、阑 尾炎、手术创口感染等。在婴幼儿、老年 人或免疫力极低的病人中可引起败血症。 肠产毒性大肠杆菌 ETEC是第三世界国家细菌性腹泻和旅游者腹泻的 主要病原之一 ETEC分泌耐热肠毒素（ ST）、不耐热肠毒素 （ LT），具有与致病性相关的菌毛等。 ETEC通过菌毛粘附在小肠上皮细胞，释放毒素 ST 和 LT，刺激腺苷环化酶或鸟苷环化酶的生产，引 起肠液分泌和聚积，产生水样腹泻。 肠侵袭性大肠杆菌 EIEC的毒力因子和致病机制志贺氏菌基本一致， 临床症状与细菌性痢疾不易区分，主要是发烧、 腹部剧烈疼痛与不适、毒血症、水样腹泻，粪便中有少量粘液和血。 EIEC通常侵犯大肠，使大肠上皮细胞刷状缘发生 局部破坏，细菌被摄入细胞内，侵犯并破坏细胞 基底膜，在细胞内扩散、繁殖，并在细胞间扩散，引起细胞的死亡，造成炎症和溃疡。 EIEC的侵袭力由 120 140MD的大质粒编码，与 编码志贺氏菌侵袭力的大质粒高度同源，丢失了质粒的菌株也随之丧失。 肠致病性大肠杆菌 EPEC是婴幼儿腹泻的主要病原菌，主要临床症状 是发烧、呕吐、腹泻，粪便中含有大量粘液而无 血，症状可持续两周以上，多引起社区的小型暴 发。 主要毒力因子包括 5070KD大质粒编码的束状菌 毛介导的粘附作用、噬菌体编码的志贺毒素及 LEE毒力岛介导的 A/E损伤。 肠出血性大肠杆菌 EHEC是指能引起出血性肠炎的一群大肠杆 菌，包括、 026:H11、 0111:H8、 O125： NM、 O122:H19等血清型的部分菌株。 目前认为 EHEC的主要毒力因子有志贺毒素、 致病性大质粒和 LEE毒力岛。 肠聚集性粘附大肠杆菌（ EAggEC） EAggEC主要与小儿顽固性腹泻有关 EAggEC产生束状菌毛（ AFF/ ）和聚集性 粘附大肠杆菌毒素 （ EAST ） AFF/ 和 EAST 的基因位于 60MD质粒上 样品的采集与处理 肠道外感染患者，应根据感染情况采取中 段尿、血液、脓液、脑脊液、胆汁等。 食品样品采集后应尽快检验，易腐食品在 检验之前应予冷藏。 粪便标本一般采集 1 3ml水样便或血样便， 成形便约 25g左右或用棉拭子采样，粪便标 本应尽快送检，如运送时间超过 2h，标本 应放在 Cary-Blair运送培养基内， 4 条件下 送检。 EPEC：婴幼儿水样或蛋花样便 EIEC：细菌性痢疾样便 ETEC：霍乱样水样便 EHEC：早期为水样便，后为血便 检验程序 肠道增菌肉汤 检样 麦康凯 37 1 18-24h 乳糖发酵或不发酵的菌落 3-5个、氧化酶， G 杆菌 TSI、靛基质、 pH7.2尿素、 KCN、赖氨酸、动力 TSI底部 +， H2S-， KCN-，尿素 - 如非左述的反应结果 血清学试验进一步鉴定 非大肠埃希氏菌 报告 直接分离培养 新鲜粪便标本接种下列培养基 麦康凯（ Mac）或伊红 -美蓝等弱选择性鉴别培养 基。 山梨醇 -麦康凯琼脂或 O157显色培养基，肠出血性 大肠杆菌及某些致病性大肠杆菌不发酵或迟缓发 酵山梨醇，菌落为无色。 血琼脂平板，用于观察肠致病性大肠杆菌的溶血 及其他菌落的鉴别， 37 培养 18-24h观察结果。 增菌培养 对于怀疑肠出血性大肠杆菌 O157:H7感 染标本，应无菌称取 25g食品或环境采集样 品，加入 225ml mEC+n（ m为 modified“改良 的 ” 的缩写， n为 novobiocin“新生霉素 ” 的 缩写）肉汤中， 37 增菌培养 6h，免疫磁 珠捕获后转种于改良的 O157显色培养基或 CT-SMAC， 37 培养 18-24h观察结果。 注： C：头孢克肟 0.05mg/L T：亚碲酸钾 2.5mg/L n：新生霉素 0.02g/L 磁珠分离 将 Ep管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用 1只 Ep 管，然后插入到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡 E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每个 Ep管的盖 子，每管加入 20L E.coli O157免疫磁珠悬液。 注意：磁珠在加入前在混旋器上短暂混匀，不可剧烈震荡，避免产生 泡沫。 取 mEC+n肉汤增菌培养物 1mL，加入到 Ep管中，盖上盖子， 然后轻微振荡 10s。每个样品更换 1只加样吸头，质控菌株 必须与样品分开进行，避免交叉污染。 注意 : 取样前混匀，避开脂肪层与杂质，必要时使用滤 网。 加样后立即混匀。对照同时做。 结合： 在 18 30 环境中，将上述 Ep管连同磁板 架放在适合的装置上转动或用手轻微转动 10min， 使 E.coli O157与免疫磁珠充分接触。 注意： 室内温度 ，保证结合时间。 结合时不要将磁铁插入到磁板架中。 用手转动时应轻轻颠倒 Ep管架，不可剧烈摇动。保证磁珠 与 O157的结合。 捕获： 将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在 3min 内不断地倾斜磁板架，确保悬液中和盖子上的免 疫磁珠全部被收集起来，此时，在 Eppendorff管壁 中间明显可见的圆形或椭圆形棕色聚物。 吸取上清液： 取 1支灭菌的加长吸管，从免疫磁珠 聚集物对侧深入液面，轻轻吸走上清液。当吸到 液面通过免疫磁珠积聚物时，应放慢速度，以确 保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁 珠，则应将其放回到 Eppendorff管中，并重复 2. 4 步骤。每个样品换用 1支加长吸管。 免疫磁珠的滑落： 某些样品特别是那些富含脂肪 的样品，其磁珠积聚物易于滑落到管底。在吸取 上清液时，很难做到不丢失磁珠，在这种情况下， 可保留 50 100L上清液于 Eppendorff管中。如果 在后续的洗涤过程中也这样做的话，脂肪的影响 将减小，也可达到充分捕获的目的。 洗涤： 从磁板架上移走磁板，在每个 Eppendorff中 加入 1mL PBS-Tween20洗液，转动磁板架 3次以上， 洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤 2.4 2.6。 重复上述步骤 2.4 2.5 注意 : 洗涤共 3次，动作要轻柔。 吸取上清液至磁珠聚集物处时，应放慢速 度。上清液的吸取应尽量完全。 使用多块磁珠分离装置时，磁铁与磁铁应 远离放置。 免疫磁珠悬浮： 移走磁板，将免疫磁珠重新悬浮 在 100L PBS-Tween20洗液中。 涂布平板 用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取 50L免疫磁珠悬液分别转移至 CT-SMAC平板和改 良 CHROMagar O157显色琼脂平板一侧，然后用 涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环 划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸 收后，翻转平板，于 36 1 培养 18 24h。注意， 若 CT-SMAC平板和改良 CHROMagar O157显色琼 脂平板表面水分过多时，应在 37 下干燥 10 20min，涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。 大肠杆菌在选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 菌落特征 麦康凯琼脂 大肠杆菌发酵乳糖，在麦康凯琼脂上呈桃红色不透明菌落 伊红美蓝琼脂 黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光 泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深 的菌落 O157显色培养基 肠出血性大肠杆菌 O157： H7呈紫红色或浅紫色菌落 山梨醇麦康凯琼脂 肠出血性大肠杆菌 O157： H7呈不发酵山梨醇的乳白色菌落或迟缓发 酵山梨醇的红色菌落 大肠杆菌在 MAC上 生化反应 从鉴别平板上挑取 5个可疑菌落， 分别接种 KIA或 TSI，靛基质试纸 片， 37 培养 18-24h。 凡分解乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多数产气， H 2S阴性，靛基质阳性的菌株，可鉴定为大肠 杆菌。 如果靛基质阴性，且 V-P试验阴 性，在西蒙式枸橼酸盐琼脂上不生长，才可证实为大肠杆菌。 肠侵袭性大肠杆菌常不分解乳糖。 血清学试验 挑取生化反应符合的菌落与大肠杆菌多价 血清作玻片凝集试验，阳性者再以该多价 血清包含的单价血清进一步鉴定。并作盐 水对照。 EPEC诊断血清包含三组多价血清及相应的单价血清 多价 1： O55、 O86、 O111、 O127 多价 2： O26、 O125、 O126、 O128 多价 3： O44、 O112、 O119、 O124 EIEC诊断血清包含两组多价血清及相应的单价血清 多价 1： O28、 O29、 O112、 O124 多价 2： O136、 O143、 O144、 O152、 O164 大肠杆菌诊断血清包含七组多价血清及相应的单价血清，可供 EPEC、 EIEC、 ETEC的诊断用 多价 1： O86、 O111、 O127 多价 2： O26、 O44、 O114、 O126、 O142 多价 3： O55、 O119、 O125、 O146 多价 4： O6、 O8、 O20、 O25 多价 5： O1、 O27、 O78、 O128、 O148、 O149 多价 6： O28、 O112、 O124 、 O136、 O143、 O144 多价 7： O63、 O152、 O158 、 O159 其中，多价 1， 2， 3包含 EPEC的 O因子；多价 4， 5包含 ETEC的 O因 子；多价 6包含 EIEC的 O因子。 谢 谢！