切片技术课件

切片技术课件显微技术显微技术(光镜光镜)切片技术课件切片技术课件Resolving power切片技术课件分辨率：分辨率：光镜：光镜：0.20.2 m m电镜：电镜：0.1nm0.1nm显微长度单位显微长度单位millimeter(mm)=10-3 metermicrometer(m)=10-6 meternanometer(nm)=10-9 meter切片技术课件 显微镜技术显微镜技术:光镜：光镜：light microscopic,LM电镜：电镜：electronic microscopic,EM透射电镜透射电镜（transmission electron microscope,TEM）：观察细胞内部结构：观察细胞内部结构扫描电镜扫描电镜（scanning electron microscope,SEM)：观察组织或细胞表面观察组织或细胞表面的立体结构的立体结构 切片技术课件光学显微镜技术光学显微镜技术 显微镜显微镜1717thth 18th 18th 切片技术课件光学显微镜技术光学显微镜技术 显微镜显微镜18/1918/19thth 19th 19th 切片技术课件Eye PiecesObjectives StageLight sourceVol.controlOn-off ButtonControlsFine focus controlCoarse focus control切片技术课件10X4 10X4 低倍观察低倍观察10X10 10X10 中倍观察中倍观察10X40 10X40 高倍观察高倍观察10X100 10X100 油镜油镜 普通生物显微镜的放大倍数普通生物显微镜的放大倍数 切片技术课件光学显微镜原理光学显微镜原理切片技术课件 荧光显微镜荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。布。切片技术课件 相差倒置显微镜相差倒置显微镜是用以观察培养细胞。一般光镜不是用以观察培养细胞。一般光镜不易分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（易分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（phase contrst microscope）才能观察。相差显微镜可将厚细）才能观察。相差显微镜可将厚细胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显，换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显，影像清晰。影像清晰。切片技术课件切片技术课件光镜标本制备光镜标本制备？切片技术课件光学显微镜技术光学显微镜技术常见标本制备：常见标本制备：HEHE染色，石蜡切片染色，石蜡切片：切片技术课件切片技术课件 切片技术课件 切片技术课件 切片技术课件Dehydration脱水透明脱水透明切片技术课件切片技术课件：切片技术课件Embedding 包埋包埋切片技术课件切片机切片机石蜡切片机石蜡切片机冰冻切片机冰冻切片机切片技术课件How does a microtome work?切片技术课件切片切片on Microtome(wax)on Cryostat(frozen)切片技术课件裱片裱片切片技术课件冰冻切片冰冻切片（切片技术课件冰冻切片冰冻切片切片技术课件 冰冻切片染色冰冻切片染色 切片技术课件切片技术课件切片技术课件HEHE染色染色 苏木精苏木精 碱性染料碱性染料被苏木精染成蓝色的特性称嗜碱性被苏木精染成蓝色的特性称嗜碱性如：细胞核，核糖体，粗面内如：细胞核，核糖体，粗面内质网等质网等酸性染料酸性染料被伊红染成红色的特性称嗜酸性被伊红染成红色的特性称嗜酸性如：细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑如：细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网）面内质网）与两染料的亲和力都不强与两染料的亲和力都不强切片技术课件1 1、取材、取材2 2、固定、固定3 3、漂洗、漂洗4 4、脱水、脱水5 5、透明、透明6 6、透蜡、透蜡7 7、包埋、包埋8 8、修块、修块9 9、切片、切片1010、染色、染色石蜡切片HE染色操作步骤切片技术课件(三三)脱水、透明和封固脱水、透明和封固切片技术课件染色染色manuallyautomated切片技术课件切片技术课件切片技术课件组织化学术组织化学术(histochemistry)(histochemistry)组织化学术组织化学术(histochemistry)(histochemistry)为应用化为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术学的原理和技术,与组织学技术相结合而与组织学技术相结合而产生的技术产生的技术,能在组织切片定性、定位地能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否、以及分布状态显示某种物质的存在与否、以及分布状态.还可进一步用显微分光光度计或图象分析还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获获得定量的信息得定量的信息.应用这种技术于游离细胞应用这种技术于游离细胞的样品的样品(如细胞涂片如细胞涂片),),则称细胞化学术则称细胞化学术(cytochemistry).(cytochemistry).切片技术课件一般组织化学术一般组织化学术一般组织化学术一般组织化学术 基本原理是在切片上基本原理是在切片上加某种试剂加某种试剂,和组织中的待检物质发生化和组织中的待检物质发生化学反应学反应,其最终产物或为有色沉淀物其最终产物或为有色沉淀物,以以用光镜观察用光镜观察,或为重金属沉淀或为重金属沉淀,以用电镜以用电镜观察观察.切片技术课件糖类糖类:常用过碘酸希夫反应常用过碘酸希夫反应(periodic(periodic acid Schiff reaction,PAS acid Schiff reaction,PAS 反应反应)显显示多糖和糖蛋白的糖链示多糖和糖蛋白的糖链.糖被强氧化剂糖被强氧化剂.过碘酸氧化后过碘酸氧化后,形成多醛形成多醛;后者再与无色后者再与无色的品红硫酸复合物的品红硫酸复合物(即希夫试剂即希夫试剂)结合结合,形形成紫红色反应产物成紫红色反应产物.切片技术课件过碘酸过碘酸SchiffSchiff反应反应(periodic acid Schiff reaction)，是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。氧化氧化 Schiff试剂试剂 多糖多糖 醛醛 紫红色沉淀紫红色沉淀切片技术课件脂类脂类:标本用甲醛固定,冷冻切片,用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色,使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色.亦可用锇酸固定兼染色,脂质呈黑色.切片技术课件核酸核酸:显示显示DNADNA的传统方法为孚尔根反应的传统方法为孚尔根反应(Feulgen reaction).(Feulgen reaction).切片切片先经稀盐酸处理先经稀盐酸处理,使使DNADNA分解分解;再用希夫试剂处理再用希夫试剂处理,形成紫红色反形成紫红色反应物应物.切片技术课件如果同时显示如果同时显示DNADNA和和RNA,RNA,则用甲基绿则用甲基绿-派派若宁反应若宁反应.甲基绿与甲基绿与细胞核细胞核DNADNA结合呈蓝结合呈蓝绿色绿色,派若宁与核仁派若宁与核仁及胞质内的及胞质内的RNARNA结合结合呈红色呈红色.切片技术课件通过显示酶的催化活性来表明酶的存在.程序是将切片置于含特异性底物的溶液中孵育,底物经酶的作用形成初级反应产物,它再与某种捕捉剂结合,形成显微镜下可见的沉淀物,即最终反应物.例如显示酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液(pH 5.0)中孵育,底物经酶水解,释放磷酸;用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应,形成细微的磷酸铅,切片技术课件切片技术课件切片技术课件切片技术课件免疫细胞（组织）化学免疫细胞（组织）化学抗原抗原（antigen,Ag）与）与抗体抗体（antibody）特异特异结合结合，用已知抗体检测未知抗原的一种方法用已知抗体检测未知抗原的一种方法。切片技术课件 对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.1.蛋白酶消化法蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.2.非特异吸附法非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物，然后再进行同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%2%左右的牛或人白蛋白左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。封片，减少非特异性染色。切片技术课件免疫组化染色中标识物的选择免疫组化染色中标识物的选择 用量微小，容易在光镜或电镜下识别用量微小，容易在光镜或电镜下识别 机体内无同一物质或类似物质机体内无同一物质或类似物质 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定合，其结合物也稳定目前常用标识物质有目前常用标识物质有荧光色素、放射性荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶同位素、重金属、微粒子、酶等等切片技术课件设立对照实验设立对照实验 为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1 1）阳性对照）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。切片技术课件免疫组化的结果判断免疫组化的结果判断染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强显色定位特定，具有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同程度显色无分布规律，某一片均匀着色 免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。著区别。切片技术课件几种常用的免疫组化检测技术 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 免疫标记电镜技术 切片技术课件免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：1 1、组织材料的处理：、组织材料的处理：常用的固定液为：常用的固定液为：10%10%中性福尔马林液；中性福尔马林液；4%4%多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4PH7.4）；）；固定时间：固定时间：8-24hr8-24hr组织大小：组织大小：2 2*1.51.5*0.3cm 0.3cm 切片技术课件2 2、防脱片处理：、防脱片处理：多聚多聚-L-L-赖氨酸；赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。硫酸铬钾明胶液。3 3、增强特异性染色的措施和方法：、增强特异性染色的措施和方法：1 1）、蛋白酶消化：）、蛋白酶消化：a a、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%0.05-0.1%）；）；b b、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（0.4%0.4%）。）。切片技术课件2 2）、热诱导的抗原修复：）、热诱导的抗原修复：方法：微波方法：微波96960 0C,10minC,10min；直接加温方法直接加温方法 1001000 0C,10minC,10min；高压锅高压锅 1201200 0C,10minC,10min；热处理液：热处理液：0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 切片技术课件3 3）、合适的抗体稀释度：）、合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；即用型抗体；浓缩型。浓缩型。切片技术课件4 4、减少、减少or or 消除非特异性染色的方法：消除非特异性染色的方法：非特异性染色：非特异性染色：原因：原因：方法：方法：切片技术课件酶标记酶标记免疫细胞（组织）化学免疫细胞（组织）化学荧光标记荧光标记切片技术课件电子显微镜技术：透射电镜电子显微镜技术：透射电镜切片技术课件透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜电子显微镜技术电子显微镜技术切片技术课件透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜切片技术课件