变性高效液相色谱原理

高效液相色谱原理DHPLC 变性高效液相色谱技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是 分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和 SNP 的最佳技术平台，其核心技 术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱。DHPLC能够分 析检测已知未知突变和SNP,技术关键是依靠这样专利技术的分离系统，在专利 技术的DNA SepCartridge分离柱中的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交 联聚合物微球体，固定相为碳T8烷烃链，PS-DVB微球体与碳-18烷烃链之间形 成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不易与核酸发生反应。 三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电 荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固 定相碳-18链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的 桥梁，因此，它作为“桥分子” 使DNA片段吸附在固定相上面。通过改变流动相中乙氰及离子对试剂的浓度实现DNA片段的分离。WAVE DHPLC 分离系统的三种操作模式：WAVE系统是一套经济、高效及多用途的仪器。标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系统的可用性。执行模式 温度 应用分离基础非变性50C测量双螺旋DNA的大小（小于2000bp）依赖大小依赖序列PCR 质量检测及纯化定量分析部分变性52-75 C变性检测依赖大平均范围） 单核酸多态性检测依赖序列完全变性75-80C测量双螺旋DNA大小（小于2000bp）依赖大小（平均范围） DNA分析（DNA SepR柱）依赖序列寡核苷酸质量（DNA SepR柱和OLIGO SepR柱）和纯度分析（片段收集器） 大量纯化需要 OLIGOSepPrepTMHC 柱DetectionandCollectionArwMical 卯Pi嘗討誚h*3 Modes ofOperation AnalysisUV and FluorescenceCloningSequencingPCR非变性条件：依赖分子量的分离WAVEMAKERTM软件能根据DNA片段分子量大小最大限度完善分离条件。在这些条件下，序列顺序并非是决定DNA洗脱方式的因素。系统在50C运行，碱基 对的数量决定洗脱顺序。这种应用在非变性条件下能将染色体插入和缺失片段分 开。一般说来，产物分子量的1%大小的片段能够被分离。例如， 100bp 的产物能 和 101bp 的产物分开， 300bp 的产物能和 303bp 的产物分开。分子量较小的核酸 片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质，而分子量较大的片段则含有较多的 磷酸盐基团结合柱基质。因此，当我们将过柱的乙腈浓度提高，核酸片段就会根 据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。在不包括柱温度和碱基对序列的影响下， 这种柱运行模式已被证明是正确的。对于想用一些已知片段大小的核酸梯度检验 其 PCR 反应的顾客，我们推荐用这种方法。伽 E jffllfl587倔4342輛257+2671741G2&0部分变性条件：根据片段大小，序列和温度的分离WAVEMAKER 软件也能预测突变检测的分析条件。在部分变性的条件下，分离 不同成分是根据核酸的大小、序列以及分析温度。以下是变性检测技术原理的阐 述，以及它是如何应用的。先设计一对 PCR 引物，使最大不超过 600bp 的 PCR 产物覆盖你所感兴趣的序列。然后将 PCR 样本移入一块 96 微孔金属板的孔中， 登录WAVE系统分析。在这步后，你就不再需要操作员的进一步帮助。在单核苷 酸突变或多态性杂交个体中，野生型DNA和突变型DNA的比率是1： 1。加热至 95C,然后慢慢冷却，使PCR产物杂交形成同源双链和异源双链的混合。在分析 含有两个等位基因（纯合突变）的DNA时，这种方法需要稍微修改一些。覆盖纯 合突变点的PCR产物与野生型扩增DNA混合并杂交。在这步骤后，样本包括异源和同源双螺旋的混合物。Wild type MutantHetero duplexes HomodupexeshW； KH一 f 警5Retention 山利与(mih)WAVE 的分析系统在能在足以使 DNA 异源双链变性（融解）的温度下运行。 融解的异源双链在离子对反相液相色谱层析与相应的同源双链分离。这个过程也 称为温度调控的异源双链层析或分析。在 DNASep 柱基质中的精确保留时间使得 对单核苷酸多态性（SNP）和短串联重复序列（STRs）的高灵敏、快速检测成为可能。在这里我们应用的一个范例是位于基因座位 DYS271 上，位点 168 的核苷 酸发生从腺嘌呤到鸟嘌呤的突变。图 4-5 显示了运用 WAVE 系统在一定范围温度 变化下四种相应的杂交产物。在用于测定DNA片段大小的非变性条件下（50C）, 所有四种杂交产物都有着相同的保留时间。当温度上升到54C时，异源双链复 制物开始在错配碱基两侧区域变性。这种变性导致 PCR 产物的双链比例减少。在 洗脱温度下，单链DNA片段比双链片段更早洗脱。这主要是因为在单链片段分子 的负电荷与双链相比较少。因此，异源双链PCR产物比同源双链含有更高的单链 的比例，保留时间更短。当同源双链DNA还尚未变性时，异源双链已经被洗脱出 来了。在55C，同源双螺旋开始变性，野生型腺嘌吟-胸腺嘧啶比突变型胞嘧啶 -鸟嘌吟型同源双链变性更快一些。最佳分离温度设为56C。两种异源双螺旋并 没有必要完全分开，因为所感兴趣的样本序列和野生型对照之间的区别表明 DNA 序列差异的存在。分辨率是依赖于突变位点，片段长度以及序列的具体构象的。WAVE Low-Range Mutation Standard_补胆一 54T-55T5657T58 -刃吃23屯TimeII ! II i670 - - - - -7 K- 5 4 3 &ruQ昌Q5QVO完全变性条件： 根据片段大小和序列的单链分析单核苷酸和 RNA 都需要在完全变性的条件下在 WAVE 系统中分析。在这些洗 脱温度下，核酸完全变性，分离是根据片段的大小和序列来实现的。想获得更多 完全变性条件的WAVE系统和分析软件的资料，请登录我们的网站 并且阅读我们的应用手册，或者打电话至Transgenomic 公司技术支持热线或服务台。