酶的提取与分离纯化

第三章 酶的提取与分离纯化 酶的提取基本概况 离心法酶的分离纯化,2、沉淀分离（根据溶解度的不同）提取 特点:使溶液中的溶质由液相转变为固相析出 古老、实用、简单的初步分离方法 生物大分子制备中常用沉淀方法： 1 中性盐沉淀（盐析法） 2 有机溶剂沉淀 3 选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 4 等电点沉淀 5 有机聚合物沉淀,2.1 盐析沉淀法（改变离子强度） 基本原理（盐溶和盐析）:向蛋白质或酶的水溶液中 加入中性盐，可产生两种现象： 盐溶（salting in） ： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 盐析（salting out） ： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。,蛋白质的盐析,离子强度 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,盐 析,盐溶,原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。,蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域,盐析用盐 常用（NH4）2 SO4，其突出优点： a. 溶解度大 b. 分离效果好 c. 不易引起变性 d. 价格便宜, 盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示: 溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度 溶液的总体积,调整盐浓度的方式 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液） 适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液. 所需添加饱和硫酸铵溶液的体积： S2-S1 V=V0 1-S2 V,V0 :分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积 S2,S1:需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度,添加固体硫酸铵 适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。 按下式计算，得表中数据 B(S2-S1) W= 1-AS2 A,B常数，与温度有关。 实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,盐析操作,低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40。 高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。 注意:固体硫酸铵要研细，温和搅拌中缓慢加入。 冰箱中（4）过夜，待沉淀完全后高速离心。 沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透 析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。,盐析曲线的制作 如要分离一种新的蛋白质或酶，应先确定沉淀 该物质的硫酸铵饱和度。 蛋白质量(mg)或酶活力,硫铵饱和度,10 20 30 40 50 60 70 80 90 100,硫酸铵浓度（%） 枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线,盐析的影响因素 离子强度和种类（介绍盐析常数） 蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：,I：离子强度，I = MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数 S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。 Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。,当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用表示，盐析方程式可改写为： log S = - Ks I 两种盐析法： Ks分级盐析法 ：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。 分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。,蛋白质浓度： 稀回收沉淀难，浓易共沉淀，2.5%-3%最好。 pH值：等电点处最易沉淀。 温度的影响： 稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。 浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。 一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在04下操作。,2.2 有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。 沉淀机理 降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 常用有机溶剂 丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。, 优缺点： 优点：分辨率比盐析法高 沉淀不需脱盐 溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：容易引起蛋白质变性失活 有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。, 影响有机溶剂沉淀的因素 温度 ：低温（0）操作。 pH 值：尽可能靠近其等电点。 离子强度：采用0.05mol/L的稀盐溶液, 增加蛋白质在有机溶剂中的 溶解度,目的防止蛋白质变性 蛋白质浓度：适当，一般为520mg/ml,2.3 等电点沉淀(isoelectric precipitation) 原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。,优点： 大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内; 无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低; 无需除掉多余酸即可进行下一步纯化. 缺点 酸化时，容易引起蛋白质失活,2.4 有机聚合物沉淀法 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。 沉淀剂： 常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG ） 多用分子量为600020000的 PEG。 优点： 操作条件温和，不易引起生物大分子变性; 沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当 多的生物大分子; 沉淀后有机聚合物容易去除。,2.5 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 热变性 所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 pH变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。,3、萃取（extraction）分离 自学 利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。 特点： 比化学沉淀法分离程度高; 比离子交换法选择性好、传质快; 比蒸馏法能耗低.,3.1 溶剂萃取法 几个概念： 料液：供提取的溶液。 溶质：料液中欲提取的物质 。 萃取剂：用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂 。 萃取液：经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与 萃取剂形成的溶液 。 萃余液：被萃取出溶质后的料液 。 反萃取:（back extraction）：完成萃取操作后， 将产物从有机相转入水相的萃取操作。,溶剂萃取法是以分配定律（溶质的分配平衡规律 ）为基础。 在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。 萃取相浓度 C1 分配系数 K0 = = 萃余相浓度 C2 K0值随溶液pH的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。,普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离,因为: 蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂; 蛋白质在有机相中易变性失活; 故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物 物质的提取。 萃取操作的3个步骤： 混合; 分离; 溶剂回收.,单级萃取:使用一个混合器和一个分离器,3.2 双水相萃取技术（partion of two aqueous phase system） 又称水溶液两相分配技术 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%90%），故称“双水相”系统。,优点： 每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境； PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。,双水相的形成： 两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。,a,双节线,系线,b,双节线,均相区,均相区,两相区,两相区,系线,临界点,PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图,几种典型的双水相系统 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖（Dex）、羟丙基葡聚糖 聚乙二醇（PEG） 葡聚糖（Dex） 硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇 羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素 聚乙二醇（PEG） 磷酸钾、硫酸铵 硫酸钠、硫酸镁,萃取原理： 利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。 应用 胞内酶的提取和精制: 除去细胞碎片，并使酶得到纯化。,几种典型的双水相萃取酶蛋白实例 酶 菌 种 相系统 延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 盐 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 盐 -半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 盐 亮氨酸脱氢酶 Bacillus sp. PEG/Dex 乙醇脱氢酶 Bakers yeast PEG/ 盐 青霉素酰化酶 E. coli PEG/ 盐,双水相萃取法的重要研究方向 -亲和萃取（亲和分配 ） 使用具有生物特异性的配基（ligand）来提高分离选择性。,亲和萃取酶实例,3.3 超临界流体萃取 兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。 超临界流体(supercritical fluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点临界点后的流体。,临界点的概念可用临界温度和临界压力解释： 临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。 临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的压力。 SCF性质介于液体和气体之间 ： SCF密度接近于液体，溶解度高。 SCF粘度和扩散系数接近于气体,传质扩散快。,基本过程： 在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。 降低压力，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。 常用超临界液态CO2作为萃取剂，因为： 液体CO2无毒 临界温度（304.06K）接近常温 临界压力（7.38MPa）较低 操作安全,超临界CO2萃取技术在生物、食品等工业中的应用 CO2萃取部分产品 原料名称 产物名称 原料名称 产物名称 小麦胚芽 胚芽油 豆子 豆油精炼油 啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 净油 辣椒 辣椒红色素 菊花根 除虫菊酯 当归 精油 紫草 紫草宁 银杏叶 银杏内酯 花生 精炼油,3.4 反胶团萃取 反胶团：又称反胶束（Reversed Micelles） 指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。,反胶团模型 亲水基团向内聚集,p154,萃取过程 第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。 第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。,反胶团萃取原理,表面活性剂及有机溶剂 反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。,表面活性剂常用： AOT(Aerosol OT)（阴离子表面活性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。 特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。 非极性有机溶剂:环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。,