琼脂糖电泳技术2

电泳缓冲液比较,琼脂糖凝胶中DNA的检测,凝胶中核酸染色方法： 溴化乙锭(EB)染色法和SYBR Gold染色法 前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用 后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用 染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15 在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色 染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min,电压,琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。 随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳,凝胶制备的注意事项,1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜） 2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长 3、EB含量要适当 4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化 5、检查梳子 6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度 7、凝胶稍厚些，避免样品溢出,电泳时间,PCR产物，应该在24h之内电泳 电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，但对小片断DNA影响明显 电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量显著较少，小片断DNA检测发生困难,凝胶拍照,曝光时间：6-10s 拍照尺寸的选取：选用大的尺寸拍摄可获得清晰的电泳图片 一般拍摄两次才可以得到清晰的照片,小结,电泳图片的影响因素： 凝胶，电泳液，EB，上样操作，拍照 好的电泳图片不一定一次就可以获得,