质粒的酶切、连接、与转化

质粒DNA酶切、连接、转化、挑选、鉴定实验目的一、学习和掌握限制性内切酶的特性二、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方式3、掌握利用CaC12制备感受态细胞的方式4、学习和掌握热击法转化的原理和方式五、掌握a互补挑选法的原理六、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方式7、温习琼脂糖凝胶电泳的原理及方式实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到适合的载体上进行体外重组。限 制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，取得目的基因的方式 也比较简单。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5-磷酸和3-羟基间形成磷酸二酯键。在分子 克隆中最有效的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性结尾的DNA片段；2、连接双链 DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下 几种：（一）、具互补粘性结尾片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够按照识别位点切割DNA分子，形成14核苷酸单链的 粘性结尾。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性结尾，连接 后仍保留原限制性内切酶的识别序列；若是用两种能够产生相同的粘性结尾的限制酶（同尾 酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，可是取得的重组DNA分子消失了原来用于切割的 那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样无益于从重组子上完整地将插入片段从头切割下 来。（二）、平结尾的连接载体分子和外源DNA插入片段并非必然总能产生出互补的粘性结尾。实际上有许多情 况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子以后所形成的都是平结尾的片段；有的实验 要用两种不同的限制酶别离切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性结尾 或平结尾；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由 RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性结尾。理论上任何一对DNA平结尾均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分 子的连接带来了方便。可是，平结尾连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平结尾的5 磷酸基团或3羟基与另一个平结尾的3羟基和5磷酸基团同时相遇的机缘显著减少，通常 平结尾的连接速度为粘性结尾的1/101/100。为了提高其反映活性，一般选择16C较为适 合。外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，重组DNA分子必需导入 适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等 的原核细胞，到真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受 体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的大体前提之一。所谓受体细胞（receptor cell）又称为宿主细胞或寄主细胞（host cell）等，从实验技术 上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究 价值的细胞。显然，并非是所有的细胞都可用作受体细胞。一般情况下，受体细胞的选择应 符合以下大体原则：（1）便于重组DNA分子的导入；（2）能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；（3） 便于重组体的挑选；（4）遗传稳定性高，易于扩大培育或发酵生长；（5）安全性高，无致 病性，不会对外界环境造成生物污染；（6）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低 的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或增进外源基因的高效分泌表达；（7） 受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；（8）具有较好的转译后加工机制，便于真核 目的基因的高效表达；（9）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞 选择的总原则，在实际应用进程中，可按照具体需要或用途而重点考虑其中部份要求即可。原核生物细胞:是较为理想的受体细胞类型，其原因是：（1）大部份原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入；（2） 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与袒露的染色体DNA重组减 少了麻烦；（3）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传 分析；（4）原核生物多数为单细胞生物，容易取得一致性的实验材料，而且培育简单，繁 衍迅速，实验周期短，重复实验快。鉴于上述原因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库， 或用来成立生产目的基因产物的工程菌，或作为克隆载体的宿主菌。至今被用作受体菌的原 核生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、应用最为普遍的原 核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。体外连接的DNA重组分子导入适合的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外 源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多不 不同的方式。本实验以大肠杆菌为受体的基因转移。转化方式：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维 持和表达的进程称之为转化（transformation）。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供 体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传互换将之组合到自身的基因组中, 从而取得供体菌的相应遗传性状的进程。以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下大体步骤：（1）细菌感受态的形成；（2）转化因子的吸收；（3）整合复合物前体的形成；（4） 单链DNA转化因子的整合；（5）转化子的形成。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性细菌有所不 同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲 缘关系较远的DNA分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质粒DNA分子的转化实验中， 很少采取自然转化的方式，通常的做法是采用人工的方式制备感受态细胞，然后进行转化处 置，其中代表方式之一是Ca2诱导的大肠杆菌转化法。Ca2诱导的转化：细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方式诱导细胞进 入感受态的操作叫致敏进程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方式，人工 诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。其原理是将处于对数生 长期的细菌置于0C, CaCL2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2使细胞膜磷脂层形 成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部份核酸酶离开所在区域，这就组成了大肠杆菌 人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶(Dnase) 的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42 C热脉冲处置后，细 菌细胞膜的液晶结构发生猛烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便乘 隙进入细胞内。Ca2处置的感受态细胞，一般每微克DNA能取得105106个转化子，环化 重组子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。转化子的挑选和鉴定：在重组DNA分子的转化、转染或转导进程中，并非所有的受体 细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只 有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子以后能良好增殖。而且它们是与其他大量未被转 化的受体菌细胞混杂在一路。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部份含有咱们所期待的 重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成 非期待重组DNA分子导入所致。因此，如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步挑选出 来，然后进一步检测到含有期待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效 果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。通常咱们将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子，而含有重组DNA 分子的转化子被称为重组子，若是重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重 组子。在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了必然的选择性遗传标记基因， 转化或转染宿主细胞后可使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组 子的初步挑选。一般的做法是将转化处置后的菌液(包括对照处置)适量涂布在选择培育基 上，在最适生长温度条件下培育一按时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。选择培育基是按照宿主细胞类型配置的培育基，对于细菌受体细胞而言，通常常利用 LB培育基，在LB培育基中加入适量的某种选择物，即为选择培育基。选择物是由载体DNA 分子上携带的选择标记基因所决定，一般与标记基因的遗传表型相对应，主要有抗菌素和显 色剂等，相应的挑选(选择)方式包括抗药性挑选、插入失活挑选和显色互补挑选等。在本实验中利用的是麦康凯培育基，用来挑选重组子。质粒PUC19进入a后，通过a- 互补作用，形成完整的B-半乳糖苷酶。在麦康凯培育基的平板上，转化子利用B-半乳糖苷 酶分解培育基中的乳糖产生有机酸，PH降低培育基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红 色。而含有外源基因片段的PUC质粒进入受体细胞后，不能形成互补的B-半乳糖苷酶活性 而出现白色菌落，这样按照这个条件即可挑选重组子。实验材料和仪器PUC19的质粒、LB培育基、麦康凯培育基提取质粒试剂盒恒温振荡培育箱，高速离心机，旋涡振荡器，水浴锅，酒精灯，微波炉，天平，电子天 平，分析天平，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖， Eppendorf管，塑料薄膜，微量移液器，手套，记号笔。LB培育基，抗生素氨苄青霉素(50ug/L), TAE电泳缓冲液(10X),琼脂糖，50XTAE缓 冲液，溴化乙锭(EB)， DNA相对分子质量标准物DNA Marker k / Hindlll 实验步骤1准备阶段I培育基的制备LB培育基麦康凯培育基枪尖的准备1000 ul、200 ul、20 ul的枪尖在枪尖盒内装好，贴上标签 EP管的准备在三角瓶内装好，不要装得太满准备好以后集体灭菌，备用2实验阶段酶切uldd HO 、4 ul PUC19 质粒DNA、ul lOXBuffer、ul Hindlll。按上述的顺序将酶切体系加好，混匀，置于37C的水浴锅内2h。制备感受态细胞（无菌条件）将事前已经培育好的OD值为左右的大肠杆菌的菌悬液置于冰上，备用； 2.2.2掏出三个EP管，在酒精灯上将菌悬液加到三个管中，每管； 2.2.3以后再离心，5000rmpX5min,离心以后将上清液倒掉（在酒精灯下） 2.2.4以后再在每管中加入的菌悬液，离心，倒掉上清液； 2.2.5加入800 ul的CaCl2混匀，以后冰浴5min；离心 5000rmpX5min,倒掉上清；2.2.7加入100 ul的CaCl2，混匀即可，以后放置在-4C冰箱中备用，或在冰 盒中。2麦康凯培育（无菌条件）2.3.2在大约培育基的温度与手背的温度差不多时，加入ul的氨苄青霉素（先预 热再将氨苄青霉素打入培育基中）；2.3.3 倒平板，大约每一个平板20ml； 连接连接体系：9 ul 的 dd H O、3ul 的 digested PUC19DNA、5ul 的 digested入噬菌体的DNA、2ul的10XBuffer、lul的T连接酶。2.4.2依照上述顺序依次加入，混匀，16C的水浴锅，连接留宿。 转化H2.5.2混合均匀，42C热击90s （时间要准确计时）； 2.5.3以后置于冰上，再在每管中加入600ul的新鲜的LB培育基；2.5.4 摇床震荡培育1h。涂布2.6.1依照以下的表格中显示的涂平板（无菌条件）2.6.2在平板上做好标记，以后在37C下培育。含量类型因20ul50ul100ul200ul含有连接液（Amp）1个(+ )2个(+)2个(+)1个(+)含puc19质粒(Amp)1个(-)空白(Amp)1 个（-）不含Amp的平板1个(+)涂布验证表格（“+”表示红色菌落的多少，“一”表示没有红色菌落） 涂布观察2.7.1观察平板上菌落的生长情况：2.7.2记录情况如上，其中不含Amp的平板上培育基变黄；2.7.3在含有Amp的平板上涂有连接液的平板上可以看到白色的菌落，这就是咱 们所需要的连接上的重组子形成的菌落，挑选红色菌落中的单独的白色菌落 进行划线培育；2.7.4用牙签轻轻挑去白色菌在含有氨苄青霉素的麦康凯培育基上划线，尽可能 将平板合理利用，不要将培育基划破；2.7.5 做好标记，继续培育。用接种环挑取平板上单独的大的白色菌落在液体培育基中（菌落的选择必 然要适当，这对于后面的验证很重要）；2.8.2挑取两管菌液，做好标记，37C振荡培育留宿；23用试剂盒提取质粒:I丨丨两个EP管中各加的菌液，lOOOOrmpXlmin，以后倒去上 清在各加菌液离心（两管菌液不要混用，可以看做两种质粒）；2.8.3.2吸取上清后，加入250微升的溶液I,充分振荡混匀，使细胞悬浮；2.8.3.3加入25微升溶液II,请求那个翻转倒置数次，直到取得透明的裂 解液;2.8.3.4加入350微升的溶液III,当即翻转倒置数次至有絮状沉生成；12.8.3.5以后离心，10000rmpX10min,吸取上清于离心柱中，离心10000rmp Xlmin,弃搜集管中的液体；在离心柱中加 500 微升的 BufferHB，离心 10000rmpXlmin,弃搜 集管中的搜集液；在离心柱中加入 700 微升的 Wash Buffer,离心 10000rmpXlmin, 弃搜集管中的搜集液；空离心柱再离心 13000rmpX2min；2.8.3.9将离心柱掏出置于的EP管中，加入40微升的Elution Buffer, 将液体加在离心柱的孔中，静置2min,以后离心13000rmpXlmin;3.10将离心柱掏出，将EP管中的质粒DNA放好，做好标记;重组质粒DNA 的酶切丨1重组质粒DNA的酶切体系：ul的dd Hj）, 4ul的重组质粒DNA,的 Buffer,，的 Hindlll；4.2依照上述的顺序，一次加入，混合均匀，置于37C的水浴锅内1h;2.8. 5.1在所得的酶切液中加入3微升的Loa ting Buffer,混合均匀点在胶 孑L中，点上相应的Hindlll的 marker；|2.8.5.2在EB中染色10min左右在紫外灯下观看实验现象，分析条带；实验结果123重组质粒DNA酶切电泳图结果分析:在上图中白左向右第七泳道即为marker带，分为多条带，在marker的右边的两I个带即为咱们组所提取的质粒DNA的酶切带：其中1为所连的目的基因，大约是左右 的大小，2为载体，条带的大小大约为，3为所连的目的基因，条带的大小大约为大小。 这两种质粒酶切以后的结果相同，说明连接的目的基因是相同的，至少在大小上是 相同的。由于是单酶切，所以重组质粒连上的不必然是单片段，可能是单片段单拷贝、 单片段多拷贝或是多片段插入等。一般来讲较大的片段不易完成连接和转化。在连接方面，载体和片段没有足够的完 整接触的机缘，且连接上的大片段对整个重组载体的生长状态会有比较大的影响,同时, 大质粒的转化相对比小质粒效率低一些，这个在图中就可以够看到，几乎没有较大的片 段，主要集中在载体周围。注意事项1.限制性核酸内切酶的酶切反映应属于微量操作技术,无论是DNA样品仍是酶的用量都 很少，必需严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全数加入反映体系。2注意酶切加样的顺序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最后加酶。前几步要 把样品加到管底的侧壁上，加完后使劲将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20C冰箱 掏出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从表面吸取，避免由于插入过深而使吸头外壁 沾染过量的酶液，掏出的酶液应当即加入反映混合也得液面以下，并充分混匀。酶液利 用完毕后当即放回冰箱，避免酶的失活。3注意盖紧Eppendorf管的盖子，避免水浴加热的进程中水汽进入管内，并注意做好标 标记以防样品混淆。4为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA 自生连接问题，为此通常选择对证粒载体用碱性磷酸酶处置，除去其5,结尾的磷酸基, 避免环化，通过接反映后的却口可在转化细胞后得以修复。5. 勿将含有DNA的凝胶长时间暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。要回收 DNA时，尽可能采用长波长的紫外灯(300360 rim)。切胶时，紫外照射时间应尽可 能短，以避免对DNA造成损伤。6. 涂布时先将涂布棒蘸取酒精，再在酒精灯火焰上烧三遍，烧时酒精会引燃，注意安全。7为了节省涂布时间，可以先涂第一组的不含氨苄的，然后是含有氨苄的，然后是第二 组，这四块平板可以一块涂。第三组的可以一块涂，可是要注意从低浓度到高浓度涂布。 &涂布时，必然要等培育基凝固完全后再涂。9.酶切、连接及转化等涉及微生物部份的实验要注意无菌操作，涉及分子实验的部份虽 然不用无菌，但要注意不要污染杂质。实验小结质粒的酶切、连接、转化、重组子的挑选及质粒的提取等操作通过一系列实验 有了进一步的了解。学会了分析琼脂糖凝胶电泳所反映出来的信息，如看片段大小、连 接结果的分析等。通过这次一系列的实验，熟悉分子实验的大体操作技术，在平时的学习中学到的很 多分子生物学和基因工程的知识都取得了应用，这些操作中的注意事项都有了了解。此 刻，通过学习，最有收获的就是相信等做完了后面的实验，自己就可以够进行一系列简 单的分子实验了。