兽医临床病理学(第九节)

第 九 节 兽 医 临 床 免 疫 学,兽医免疫学是一门研究动物机体识别自身和非自身物质的一系列复杂的生物学反应的科学。 近二十年来，免疫学无论在理论上实践上都有飞跃发展。由于免疫学知识迅速渗透到医学科学的各个领域，并且与许多学科交织在一起，从而进一步发展为免疫生物学、免疫化学、免疫血清学、免疫遗传学、免疫病理学、移植免疫学和临床免疫学等。兽医免疫学侧重于免疫血清学和抗感染免疫。,一 、免疫的基本特性 1.识别自身和非自身 只有基因型完全相同的个体，如同卵双生的兄弟姐妹或近系小鼠才能进行异体组织或器官的移植并不被排斥。 识别功能对保证机体的健康是十分重要的， 识别功能的紊乱，会导致严重的生理失调，把自身的物质或细胞会当成敌人，就会造成自身免疫病。,2.特异性 免疫应答有高度的特异性，它能对抗原物质极细微的差异加以区别。如接种猪瘟疫苗就可以获得对猪瘟病毒的免疫力，但不能抵抗对其他病毒的抵抗力。 就象“钥匙”与“锁”的关系一样。 3.免疫记忆 抗原动物体抗体消失。抗体消失后，用同源抗原加强免疫时，能迅速产生比初次接触抗原时更多的抗体。这说明机体有免疫记忆作用。在初次接触抗原之初，除刺激机体形成产生抗体的细胞外，同时也形成免疫记忆细胞。 动物某种传染病康复或用疫苗接种后，可产生长期免疫力，亦归于免疫记忆作用。,二 、免疫的基本功能 1.抵抗感染 又称免疫抵抗，就是动物机体抵抗病原微生物感染和侵袭的能力。 通过机体的非特异性免疫和特异性免疫，将微生物消灭。 2.自身稳定 又称免疫稳定，就是清除在新陈代谢过程中，产生大量的衰老死亡的细胞， 以维持机体的生理平衡。若此功能失调，就会导致自身免疫病。 3.免疫监视 监视机体肿瘤细胞，一旦出现，加以识别，然后清除,三、 免疫的分类 非特异性免疫 是机体生来就有的一种防御功能，故又称为先天性免疫， 特异性免疫 是机体在后天受到异物刺激，而产生的对该种异物的免疫清除作用，故又称为获得性免疫。,抗原特征 性质上有严格的限制 必须是异物性的，必须是分子类型的； 抗原敏感细胞对不能辨认出是异物的物质是不发生反应的。 外来物质(病原体、异种动物血清)均能引起较强的免疫反应。 不同动物间种属关系越远，组织结构差异越大，抗原性越强。, 自身组织和细胞也可形成自身抗原 如甲状腺球蛋白、眼球晶体蛋白、精子及神经组织的髓磷脂等，由于外伤、炎症或其它原因，使之溢出于封闭组织之外而成为自身抗原。 分子较大（一万）、化学结构复杂而稳定 有半抗原或不完全抗原 某些小分子化合物只有反应原性，本身没有免疫原性，只有与大分子胶体物质（如蛋白质）或不溶性颗粒（如聚苯乙烯乳胶颗粒）结合后才获得免疫原性。 如霉菌毒素、多肽激素、药物等许多半抗原物质，都可利用物理吸附和化学方法制备成免疫原，从而制取诊断用抗血清，以供临床诊断和治疗之用。,2.抗体（免疫球蛋白） 能与抗原特异性结合并且具有特定结构的球蛋白（绝大部分是球蛋白，少部分是球蛋白），可以发挥免疫效应和免疫反应，故又称免疫球蛋白（Ig）。 按化学结构特性可分五类： 即 IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。 它们都是由一至几个单体组成，每一个单体的基本结构有四条肽键，它们包括两条重链和两条轻链，各条链之间由二硫键连接。,球蛋白的作用 IgG IgG存在于血清及整个组织液中，是血清中浓度最高的一类抗体。它能与补体结合，灭活病毒，溶解病原体及细胞，中和毒素，提高特异性体液免疫。 IgM IgM是第二高浓度的免疫球蛋白。IgM具有广泛结合抗原的能力，在凝集、沉淀、调理、补体激活和病毒中和等方面是一种非常有效的抗体。, IgA IgA有血清型和分泌型两类。 主要起中和病毒、抗御微生物入侵、阻止病原菌与靶组织的粘着等作用。 IgE 家畜中的有关报道较少，现已证实在犬、牛、猪和马中，都有IgE的存在。 它能同某些组织细胞（ 肥大细胞和嗜碱性白细胞）相结合，与抗原一起促使这些细胞释放血管活性物质，介导型超敏反应，并参与许多蠕虫病的免疫应答。 IgD IgD在人类、小鼠、猪和鸡中均存在，但在其它家畜尚未证实。,抗体生成过程中细胞的相互作用 B淋巴细胞 为一种抗原敏感细胞。 B 细胞接触抗原后转化成产生抗体的浆细胞。 B 细胞膜载有抗原受体，这些受体实际上是免疫球蛋白分子，并具有一片额外的多肽链，将Fc片段固定在细胞膜中。每一个B细胞的受体具有一个唯一的可变区，允许其与特定的抗原决定族起反应。 B 细胞受体的这种特异性是抗体生成克隆的分泌理论的基础。在B细胞克隆发育期间，细胞表面首先出现IgM,随之结合IgD,最后出现如IgG或IgA的其它亚型受体。抗原与B细胞表面受体结合，引起一系列的细胞分化，直至形成一种能产生抗体的浆细胞和记忆细胞。, 辅助T细胞和白细胞介素 T细胞是胸腺依赖细胞，在胸腺成熟，随后迁移并定居在次级淋巴器官（淋巴结的副皮质区）。 T细胞也具有抗原受体，与B细胞膜上的免疫球蛋白受体具有一些共同特征。 大多数抗原要求B细胞和T细胞之间的协作， 巨噬细胞产生的细胞介素1（IL-1）能激活辅助T细胞。 辅助T细胞识别具有主要组织相容性复合体类抗原的自身非T细胞，并受到IL-1的刺激，产生B细胞生长因子和IL-2（T细胞生长因子），T细胞在其表面具有IL-2受体，IL-2与其受体结合，具有引起有活性T细胞的增生、诱导同种抗原以刺激T细胞产生干扰素以及调节T细胞等功能。,（二）细胞免疫 T细胞受抗原刺激后，经增殖分化产生两种细胞群，一群是长寿的记忆细胞，另一群是效应T细胞，后者与相应抗原接触后，除直接杀伤带抗原的细胞外，还释放出各种可溶性的生物活性物质，发挥免疫效应。 对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或器官移植的外来细胞，其细胞介导杀灭作用是由细胞毒T细胞来完成的。 T 细胞能合成和分泌各种非抗原特异性的生物活性蛋白质，称为淋巴因子，如干扰素和淋巴毒素等。 干扰素能激活巨噬细胞，增强其杀灭被吞噬抗原的能力。细胞内的细菌在未被激活的巨噬细胞内仍然存活，但通过干扰素的激活，增强了巨噬细胞内酶的活性，从而提高了巨噬细胞的杀伤能力，使其内的病原体迅速被杀灭。,六、免疫学诊断 免疫学诊断是指运用免疫学方法对机体免疫功能和疾病进行诊断。 免疫学的诊断方法很多，应用范围很广，不仅可用于传染病的诊断，还用于变态反应性疾病、肿瘤、组织移植、免疫缺陷病和自身免疫性疾病的诊断。 免疫学诊断方法必须符合特异性强、灵敏度高和方法简便等要求。,（一）抗原和抗体的检测 检测原理 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量检测。,检测方法 1.沉淀反应 可溶性抗原与抗体结合，在两者比例 合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应(precipitation neaction)。,根据操作方法不同分为： 环状沉淀试验 主要用于炭疽的诊断； 絮状沉淀试验 用于毒素、类毒素、抗毒素的定量测定 凝胶中沉淀试验 是许多传染病（马传贫、牛白血病、蓝舌病 等）的流行病学调查和检疫的主要手段。,2.凝集反应 某些病原微生物和红细胞等颗粒性抗原与相应 抗体结合后，在有适量电解质存在下，可逐渐聚集 最终出现肉眼可见的凝集小块称为凝集反应。 根据这一原理建立的凝集试验，在临床免疫学 检验中应用较多。 如检测血清IgG和与怀孕有关的激素、自身免疫 性溶血性贫血的诊断等。,根据抗原的性质和反应的方式可分为： 直接凝集试验 颗粒性抗原与抗体直接结合，并出现凝集现象的试验称为直接凝集试验。 主要用于新分离细菌的鉴定和待测血清中抗体检测。, 间接凝集试验 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒（统称为载体颗粒）的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应。 间接血凝试验主要用以检测相应的抗原和抗体。, 乳胶凝集试验 乳胶是聚苯乙烯聚合的高分子乳状液，对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好吸附性能，可用作载体吸附某些抗原(抗体)来测定相应的抗体(或抗原)。本法具有快速简便、保存方便、比较准确等优点。 协同凝集试验 葡萄球菌A蛋白（SPA）是金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物IgG分子的Fc片段结合。SPA与IgG结合后，后者的Fab段暴露于外，并保持其抗体活性，当此SPA特异性抗体与相应的抗原结合时，就可产生凝集反应。本法已广泛应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。,3.补体结合试验 补体结合试验（CF）是在补体的参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统，以已知的抗原（或抗体）和受检的抗体（或抗原）作为被检系统，共同在一起孵育，根据溶血现象是否产生，以检查被检系统在有无相应的抗体或抗原存在的一种血清学试验。 该试验虽操作繁琐，但灵敏度和特异性较高，所以仍是免疫学诊断中应用最广泛的一种试验。 主要用于布病、马鼻疽、球孢子菌病、钩端螺旋体病、结核病等的诊断。,4.中和试验 中和试验指病毒或毒素与相应的抗体结合，失去对易感动物的致病力，称为中和试验。 中和试验主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒的鉴定、疫苗免疫原性的评价、免疫血清的质量评价和动物血清抗体的检测等。 中和试验分为：简单定性中和试验、终点法中和试验和空斑减数试验三种。,5.免疫荧光技术 (immunofluorescence technique) 免疫荧光技术是抗原与抗体结合反应与形态学相结合的一种方法。将抗体或抗原标记上荧光素后，与相应的抗原或抗体发生特异性较好，在荧光显微镜下可看到发出荧光的抗原抗体反应，从而可对标本中相应抗原或抗体进行鉴定和定位，这种检验技术又称荧光抗体技术。这一技术的优点是既有免疫学的特异性和敏感性，又有显微镜的精确性和直观性。 免疫荧光技术主要用于各类病原微生物（病毒、细菌）和寄生虫的快速诊断。,6. 酶标抗体技术（免疫酶技术） 用酶(辣根过氧化物酶)标记抗体，来检查未知抗原，进行抗原定性、定位，在普通显微镜下或用酶标测定仪来检查抗原抗体复合物的技术，称为酶标抗体技术。 免疫酶技术与固相免疫荧光技术（FIA）相类似，它是一种利用酶作为抗原或抗体标记物的标记免疫检测方法，可分为固相酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶免疫组织化学技术酶。, ELISA 具有极高的敏感性，既可用于抗体和抗原的检测，可用于激素、药物、肿瘤胎儿蛋白或自身免疫性疾病等非传染性疾病的诊断。 酶免疫组织化学技术 具有敏感、能在石蜡包埋的组织上进行、片子可长期保存及不需要荧光显微镜等优点，可广泛用于传染性疾病和自身免疫性疾病的诊断。,7.放射免疫技术(Radioimmunoassay,RIA) 是放射性同位素分析的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来的技术。 特点：灵敏度高、特异性强、准确性好。 可用于检测动物血浆和体液中的微量物质，包括激素（胰岛素、甲状腺素、雌激素、FSH、-兴奋剂）、药物（洋地黄）等。,（二）免疫检测新技术 1.SPA免疫检测技术 【原理】 葡萄球菌A蛋白（SPA）免疫检测技术是根据SPA能与多种动物IgG的Fc端结合的原理，用SPA标记物（酶、荧光、放射性等标记）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测试验。最早于1982年建立了酶标SPA的ELISA试验。,【方法】 SPA放射免疫分析 此法灵敏度高，可测出ng/ml的抗体含量，需时短，重复性好。 SPA酶标检测技术 用辣根过氧化物酶标记的SPA（HRP-SPA）可用于酶免疫组织化学法染色。 用HRP-SPA建立ELISA则具更多的优越性，即它可作为多种动物，以及同一种动物多种抗原抗体检测的通用试剂。如国内已建立了检测猪瘟的SPA-ELISA试剂盒 。 SPA荧光抗体技术 荧光SPA主要用于淋巴细胞表面标志研究，亦可代替荧光抗体进行病毒抗原、肿瘤抗原等的检测。,2.胶体金免疫检测技术 胶体金免疫检测技术是本世纪80年代发展起来的一项新技术。它是用胶体金颗粒标记抗原或抗体，进行抗体或抗原的检测或定位分析。 方法有： 胶体金免疫凝集试验 具有试剂稳定、用量少、反应快、易于肉眼判定反应结果（红色）特点，优于红细胞凝集试验和乳胶凝集试验。, 胶体金免疫光镜染色 用标记有抗体的胶体金颗粒与组织切片反应，在光学显微镜下观察胶体金颗粒的结合部位，可进行抗原定位 方法简便，定位准确。 胶体金免疫电镜染色 可用于抗原或抗体的检测。用抗体包被的胶体金颗粒处理超薄切片样品，在电镜下还可进行抗原的亚细胞水平定位分析。,3.核酸探针技术 (nucleic acid probe) 核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。 核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。 每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。,核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。 DNA探针常用于病毒性疾病的诊断； cDNA探针常用于RNA病毒的检测。 将信息RNA（mRNA）标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，因此应用较少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。,