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第十章 甾体激素类药物的分析Analysis of steroid hormones,激素（Hormone，荷尔蒙） 是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质。激素作用于特定的称为靶器官的组织、细胞上而发挥作用。如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。,概 述,甾体激素类药物均具有环戊烷骈多氢菲母核。,第一节 基本结构与性质,按照C10,C13,C17取代基不同分类,按药理作用分类,第一节 基本结构与性质,43酮基 （紫外吸收）,天然皮质激素：氢化可的松,孕甾烷母核有21个碳原子,C17醇酮基 （还原性）,孕甾烷母核,第一节 基本结构与性质,3,11,17,20,21,氢化可的松 (hydrocortisone),醋酸地塞米松 (dexamethasone acetate),16-甲基,21-酯化,17-羟基,9-氟,3-酮,1,2-双键,11-羟基,20-酮,第一节 基本结构与性质,第一节 基本结构与性质,A环4-3-酮基,为共轭体系,在波长240nm附近有紫外吸收,部分药物在C1-C2之间有双键,也有紫外吸收,肾上腺皮质激素类药物结构特征,第一节 基本结构与性质,C17位上为-醇酮基,具有还原性.多数药物有C17-羟基,部分药物-醇羟基与酸成酯.,第一节 基本结构与性质,部分药物的C6或C9位由卤素取代,呈相应的卤化物反应,第一节 基本结构与性质,部分药物C11位上有羟基或酮基取代,第一节 基本结构与性质,甲睾酮 (methyltestosterone),丙酸睾酮 (testosterone propionate),苯丙酸诺龙 (nandrolone phenylpropionate),17-羟基,第一节 基本结构与性质,甲睾酮 (methyltestosterone),A环4-3-酮基,C17位上为羟基,部分药物的羟基被酯化,雄性激素上的母核为19个碳原子,蛋白同化激素在C10位上一般无角甲基,母核只有18个碳原子,第一节 基本结构与性质,A环4-3-酮基,C17位上有甲酮基或乙炔基.,孕甾烷母核有21个碳原子,口服被迅速破坏失效，只能肌注,43酮基,第一节 基本结构与性质,黄体酮 (progesterone),醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate ),米非司酮 (mifepristone),第一节 基本结构与性质,天然的雌性激素：雌二醇,雌甾烷母核有18个碳原子,A环为苯环，C3位上有酚羟基，C17位上有羟基,结构不稳定，口服无效,第一节 基本结构与性质,结构修饰,炔雌醇,戊酸雌二醇,苯甲酸雌二醇,乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增加空间位阻，阻碍酶对药物的氧化代谢，可口服,17位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效,3位羟基酯化，酯在体内缓慢水解，延效,可口服 高效 长效,人工合成代用品：非甾体化合物,己烯雌二酚,高效、长效,第一节 基本结构与性质,特殊官能团与分析方法,第二节 理化性质与鉴别试验,白色至微黄色粉末或结晶性粉末。 三氯甲烷中微溶至易溶； 甲醇或乙醇中微溶 乙醚或植物油极微溶 水中不溶,1. 性状与溶解度,第二节 理化性质与鉴别试验,2、熔点 一具有鉴定的意义；二则可以反映药物的纯度。 炔诺酮：熔点202208 3.比旋度 甾体激素多具有手型碳原子，具有旋光性。 4.吸收系数,第二节 鉴别试验,（一）强酸的呈色反应,强酸： H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl,原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与HSO4-作用呈色。,与硫酸显色反应,1. C17-醇酮基还原性,2.C3酮基和C20酮基,成腙反应中,C20酮基受C18甲基的空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。,C3酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下生成单腙。,3.甲酮基或活泼亚甲基,适用：具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物。,能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色。,黄体酮专属性反应。,黄体酮,其他甾体,亚硝基铁氰化钠,蓝紫色,淡橙色或不显色,又称为碱性硝普钠反应。,碱性,甲酮基：,有机氟,F,有机破坏,有机氯,4、卤元素的呈色反应,茜素氟蓝硝酸亚铈,硝酸硝酸银,呈蓝紫色,Cl,AgCl,氯原子结合在母核环上,适用：雌激素类药物。,5.酚羟基的呈色反应,能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料。,JP利用此反应鉴别苯甲酸雌二醇,6. 乙炔基,含炔基的甾体激素，炔诺酮，炔雌醇等,原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。,7、酯的水解产物的反应,适用： 本类药物C3、C17或C21位上羟基的酯,结果： 醋酸酯水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。,戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别。,-3-酮,240nm左右,280nm左右,苯环,其他共轭结构,200-760nm有特征吸收。,可规定最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小。,原 理,方 法,示 例,结构特征： 酚羟基 C17 OH C17 乙炔基,例:炔雌醇,1505cm-1,3505cm-1,3300cm-1,1590cm-1,3610cm-1,酚羟基,醇羟基,1615cm-1,苯环的骨架振动,eg2：黄体酮,结构特征： -3-酮 C17-酮基,1700cm-1,C=O,20位酮基,1665cm-1,3位酮基,1615cm-1,870cm-1,C-H,双键,第三节 特殊杂质检查,杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。 其他甾体：有些杂质与该甾体激素药物结构类似，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显得很重要。,检查方法：,判定方法：规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色,1、TLC法（自身对照法）,eg：氢化可的松中其他甾体的检查 供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 浓度：3.0mg/ml 对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1） 60g/ml 层析：供试液 对照液 点样、展开、斑点检出。 判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,氢化可的松中其他甾体检查,图A中峰1面积的四分之三,判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,2、HPLC法（自身对照法）,杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺，药物可能引入杂质硒。,方法：,结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液的吸光度（0.0050.01） 。,eg：地塞米松磷酸钠,方法：GC色谱法,杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。,结果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量0.3 丙酮规定不得过5.0%,方法：对照品（KH2PO4），磷钼酸比色法,杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯化时残存的过量磷酸盐。,结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度。,740nm,原理：供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 钼蓝,第四节 含量测定,（一）四氮唑盐比色法,（1）原理：肾上腺皮质激素类C17-醇酮基强还原性。,三苯甲瓒深红,（2）方法：对照品法,（3）影响因素,A. 基团对反应速度的影响,C11= OC17OH,C21OH未酯化C21-OH酯化,B、溶剂和水分的影响,以无水无醛的乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5对结果没有影响。,C、O2与光线的影响,避光、隔绝空气、快速、充N2除去O2,D、碱的种类及加入顺序,以氢氧化四甲基铵的结果最佳,加入顺序：皮质激素溶液,四氮唑盐,碱试液,皮质激素与碱接触会部分分解,E. 温度与时间,室温（25）反应4045 min,F. 干扰物的影响,选择性的测定C17位未被氧化和降解的药物 氧化物和水解产物不发生反应,1.原理,异烟腙（黄）,HCl,420nm,（二）异烟肼比色法,C3-酮基+异烟肼,H2O,肾上腺皮质激素 雄性激素 蛋白同化激素 孕激素,2.方法：对照品法,3.影响因素,A.反应速度（反应专属性）,C3=OC17= O 、C20= O C11= O 不反应,B. 溶剂的选择,异烟肼盐酸盐受溶解度的影响,无水甲醇 无水乙醇,甲醇对试剂的稳定性好 甲醇呈色强度较无水乙醇中高 乙醇对植物油的溶解度小,C.水分、温度、O2与光线的影响,含水量腙水解A%,O2与光线对反应的影响不大,t ,D.酸的种类和浓度及异烟肼的浓度,酸:异烟肼 = 2:1 吸光度最大,4-3-酮基的甾体激素在室温不到1h即可定量地与酸性异烟肼反应；其他长时间放置或加热后方可反应完全，因此在反应条件下，本法对4-3-酮基甾体具有一定的专属性。,E:反应的专属性,原理,max=515,又称为铁-酚试剂法,（三）Kober反应比色法：,雌二醇-3-甲醚,max=465,max=515,要求：专属性强、灵敏度高； 甾体激素给药量少；血药浓度在ng/mL；-灵敏性 生物体内有内源性甾体激素，甾体激素药物在体内有多种代谢产物；-专属性,本章小结,1.结构：三种母核（雄甾烷，雌甾烷，孕甾烷） 各类激素的结构特点 2.性质和鉴别 与强酸呈色； 官能团反应（C17-醇酮基；C3-，C20-酮基；C17-甲酮基；酚羟基，炔基；卤素；酯反应） 紫外，红外，色谱 3. 杂质与检查 有关杂质（TLC，HPLC）；硒的检查；残留溶剂； 游离磷酸盐 4.含量测定 HPLC,UV,比色法（四氮唑盐，异烟肼，Kober反应）,简答题： 1、简述异烟肼比色法测定甾体类激素药物含量的原理及注意事项？ 2、简述四氮唑比色法中的注意事项。 3、甾体类激素药物可能含有哪些特殊杂质？各采用什么方法检查？ 4、甾体类激素药物有哪些鉴别方法？,
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