细胞活体染色技术.ppt

细胞活体染色技术,2,实验目的,学习细胞活体染色的方法。 观察动、植物活细胞内线粒体，液泡系的形态、数量与分布。,3,细胞膜结构,4,实验原理,一般的生物材料不能穿透细胞膜，只有当细胞被固定后，细胞膜被破坏，染料才能进入细胞内部。但是，有一些染料（称“活体染料”）却能进入活细胞，它们是一些无毒或毒性很小的染色剂，能使细胞中某些特定结构着色。活体染料基本上不影响或很少影响细胞的生命活动。,5,活染法弥补了活观察法不能显示细胞精细结构的不足，也避免了固定染色法对细胞结构的破环和造成人为假象的弊病。遗憾的是，适宜活体染色的染料较少，能显示出的结构和种类也不多。 活体染色分为体内活染和体外活染两种。前者是将染料注射于生物体内，染色后再取材观察。后者是取材后，对离体的活细胞进行染色。为保持离体细胞的正常存活，染色时需供给细胞以正常的温度，渗透压，PH等。,6,活体染色,7,较为常见的活体染色剂,詹纳斯绿B(Janus green B) 中性红 台盼蓝(trypan blue),8,詹纳斯绿B(Janus green B),专一用于线粒体的染色。它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合，保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态。 必须指出的是，只有具有活性的细胞色素C氧化酶才能够把詹纳斯绿B氧化，从而使它显出颜色,9,人口腔上皮细胞的线粒体分布,在实验过程中务必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料置于的冰水浴低温中，并且操作要迅速。,10,11,中性红,中性红是液泡系的特殊活体染色剂，它可将不同发育时期的液泡染成不同深度的红色，在细胞处于生活状态下细胞质和核不被染色，该染料对液泡系具有一定专一性。,12,13,液泡系的中性红染色点经观察,14,台盼蓝(trypan blue),台盼蓝：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。 通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。注意凋亡小体也有台盼蓝拒染现象。,15,16,实验用品,材料：黄豆根尖、洋葱、小鼠。 器械：显微镜、镊子、刀片、剪刀、解剖针、 表面皿、载玻片、盖玻片、吸管、收水纸等。 试剂： Ringer氏液 13000中性红溶液 15000詹纳斯绿B 台盼蓝染色液 香柏油、二甲苯、蒸馏水等,17,实验方法,1. 液泡系的中性红活体染色,取黄豆芽的根尖处的纵切面 于载玻片上的中性红染液中染色510min 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检,18,2.线粒体的活体染色 用植物细胞观察线粒体的活体染色 撕取洋葱鳞茎内表皮一小块 于载玻片上的1/5000 Janus green B染色30min 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检,19,娶取鼠肝肝组织一小块，放入盛有Ringer氏液表面皿中洗去血液 于载玻片上的1/5000 Janus green B染色30min 撕开组织块，这样溶液中会有一些细胞或细胞群 吸取溶液，放在载玻片的Ringer氏液中 垫上两根短头发，盖上盖玻片进行镜检, 用动物细胞观察线粒体的活体染色,为什么要用油镜观察，植物细胞却不用？ 为什么要垫上两根短头发？,思考,20,3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察,清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上 滴2滴1/5000 Janus green B染液 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) 盖上盖玻片,显微镜下观察,21,4. 台盼蓝染色鉴定细胞死活,取小鼠腹腔水细胞于洁净载玻片上 滴加1%台盼蓝1滴 盖上盖玻片于显微镜下进行镜检,22,注意事项,对口腔上皮细胞进行染色时不可使染剂干燥，可适当补加染液。 在对植物进行观察时一定要让材料尽量展开。 詹纳斯绿B(Janus green B)溶液现用现配，以保持它的充分氧化能力。 试验中速度要快，以免组织细胞死亡,23,思考题,所观察到的液泡大小是否有差别，染色深度是否一样，并绘图加以说明。 所观察到线粒体分布在细胞何处呈什么颜色，其形状如何，绘图加以说明。 比较线粒体在动、植物中的分布、颜色，其形状如何?,24,thanks,