尼克酸(维生素PP又称烟酸)的测定方法

尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(1)此处介绍微生物法、比色法以及复合维生素制剂中的烟酰胺测定方法(分光光度法)一、微生物法1. 原理一种微生物生长必需某一些维生素，Lactobacillus arabinosus的生长需要尼克酸。尼克酸是指具有尼 克酸生物学活性的吡啶 3-羧酸及其衍生物的总称。它是白色晶体，是维生素中最稳定的一种，对酸、碱、 热、光及弱氧化剂都很稳定，微溶于冷水，易溶于热水及乙醇。其检出限为 10ng。2. 适用范围本方法来源自AOAC和国标GB12395-90。适用于食物及饲料中的尼克酸的检测。3. 仪器(1) 电热恒温培养箱(370.5C)(2) 无菌室(紫外灯消毒)(3) 电热手提式压力蒸汽消毒器(121C，高压30min)(4) 液体快速混合器(5) 离心机(3000 转， 10min)(6) 碱式滴定管(7) 硬质玻璃试管4. 试剂所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水4.1 标准溶液的配制(1) 尼克酸标准储备液(O.lmg/ml)：准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸 标准，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml,于冰箱中保存。(2) 尼克酸标准中间液(lug/m):吸取1.00ml尼克酸标准储备液，置于100ml容量瓶中，用25%乙醇溶 液定容，混匀，于冰箱中保存。(3) 尼克酸标准工作液(0.1ug/m):临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液，置于50ml容量瓶中，用水 定容，混匀。4.2 其它试剂的配制(1) 0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。(2) 10mol/L 氢氧化钠：溶 200g NaOH 于水中，稀释至 500ml。(3) O.lmol/L 氢氧化钠：，取 10ml 10mol/L NaOH，用水稀释至 1000ml。(4) 0.04%溴甲酚绿溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml 0.1mol/L NaOH研磨，加少许水继续 研磨，直至完全溶解，用水稀释到 250ml。(5) 酪蛋白(sigma公司)：称取50g不含维生素的酪蛋白，加200ml (3mol/L)盐酸，121C磅压力下 水解6小时，将水解物转移至蒸发皿内，在水浴上蒸发至膏状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，反 复3次，以除去盐酸。注意：*酸解酪蛋白是为了去除酪蛋白中的维生素，确保培养基中不含代测的尼克酸，但酸解并不一定彻底， 因此选用不含维生素的酪蛋白。*水浴蒸发时不可蒸干或使之焦糊，若溶液被蒸干，水解液所含营养物已被破坏用10mol/L氢氧化钠调节PH值至3.5，以溴酚蓝作外指示剂。加20g活性炭，振摇，过滤，反复操作至滤 液无色。滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯置冰箱中保存。*注意：活性炭不能在溶液中太久，否则容易破坏酪蛋白的营养成分(待续)尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(2)(6) 溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1+4乙醇溶解后，再加乙醇稀释至100ml。( 7 ) 甲苯(8) 4mol/L 盐酸溶液，V+V=1+4(9) 5mol/L 生理盐水：取 9gNaCl 溶于 1000ml 水中。(10) 胱氨酸、色氨酸溶液：称取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸溶于800ml水中，加热至7080C，逐滴加 入20%盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000ml。加少许甲苯于冰箱中保存。(11) 腺嘌吟、鸟嘌吟、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌吟，盐酸鸟嘌吟及尿嘧啶各0.1g，加75ml水和2ml 浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加浓盐酸数滴，再加热。如此反复，直至冷却后 无沉淀产生为止。用水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。(12) D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液：称取D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg 于烧杯中，以水溶解并稀释至1000ml，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。*注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中(13) 0.02mol/L醋酸溶液：取1.18ml纯的冰醋酸，稀释至1000ml(14) 核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液：溶解1mg生物素结晶于100ml 0.01747mol/L的醋酸中，取此 液4ml （相当于40ug生物素），加入20mg核黄素和10mg盐酸硫胺素，以0.01747mol/L醋酸溶解并稀释至 1000ml，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。*注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中（15）甲盐溶液：取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾，加水溶解后稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中 保存。（16） 乙盐溶液：取10g硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g硫酸亚铁和0.5g硫酸锰，加水溶解后稀释至500ml， 加 5 滴浓盐酸，加少许甲苯于冰箱中保存。（17）乙醇溶液 V/V=1/3（18）溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1+3乙醇溶液溶解后，再稀释至100ml。（19）0.04%溴麝香草酚蓝溶液：称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中，加1.6ml, 0.1mol/L NaOH，研磨， 加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至 250ml。（20）0.004%溴麝香草酚蓝溶液：量取100ml0.04%溴麝香草酚蓝溶液，加水稀释至1000ml，供滴定用。（21）基本培养基储备液：酸解酪蛋白 50ml胱氨酸、色氨酸溶液 50ml腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 10mlD-泛酸钙、对氨基苯甲酸、吡哆醇溶液10ml 核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液 10ml甲盐溶液 10ml乙盐溶液 10ml无水葡萄糖 10g无水醋酸钠 10g（或结晶醋酸钠NaAC.3H2O 16.6g）将上列试剂混合，用水稀释至500ml用氢氧化钠调PH至6.8，以溴麝香草酚蓝作外指示剂。（待续）尼克酸（维生素PP,又称烟酸）的测定方法（3）（22）琼脂培养基： 无水葡萄糖 1g 醋酸钠 1g 蛋白胨 0.8g 酵母提取物干粉 0.2g 甲盐溶液 0.2 ml 乙盐溶液 0.2ml 琼脂 1.2g混合，加水至100ml,加热至琼脂完全溶化，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用盐酸趁热调PH至6.8,尽 快倒入试管中，每管35ml,加塞棉塞，于压力蒸汽消毒器中121C灭菌10min,取出后竖直试管，冷至 室温后保存于冰箱中。4.3 菌种的制备与保存（1）菌种的制备与保存：以阿拉伯乳酸杆菌 Lactobacillus arabinosus 17-5 ATCC No.8014 简称 Lact.A ?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在370.5C恒温箱中保温16-24小时，取出于冰箱中保存， 至多不超过两周。保存数周以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天转种一次， 连续2-3天，方可使用，否则生长不好。（2）种子培养液的制备：加5ml 0.1ug/ml的尼克酸标准应用液于尖头试管中，加入5ml基本培养基， 塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）121C下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保存数周之久。5. 操作步骤5.1样品制备：取含尼克酸约5-50ug的均匀样品于100ml三角瓶中，加0.5mol/LH2S0450ml。放入高压蒸 汽锅121C下水解30min，取出，于水中冷却，用10mol/LNa0H和0.5mol/LH2S04调PH值至4.5，用溴甲 酚绿做指示剂。将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液 于冰箱内备测（保存期不超过36小时）。*用0.5mol/L硫酸水解，可以断开尼克酸和其它物质结合的键，使尼克酸游离出来。*观察溴甲酚绿至草绿色为终点，说明溶液PH值到了 4.5.调PH值至4.5可以除去样品中刺激和抑制细菌 生长的物质，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。许多蛋白质的等电点也在PH4.5,所以此PH值也可用来沉淀蛋白 质。5.2 接种液的制备：使用前一天，将阿拉伯乳酸杆菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可 同时制备两管，在370.5C的恒温箱中培养16-24小时。取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体， 用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌 种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。5.3样品标准曲线的测定：3组试管各加0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5和3.0ml工作液，每管加水稀释至 5ml,再加5ml基本培养基，混匀，加棉塞。（待续）尼克酸（维生素PP,又称烟酸）的测定方法 （4） 5.4试样的测定：在试管中分别加入1, 2, 3, 4ml样液，加水稀释至5ml,再加入5ml基本培养基，用棉 塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅(121C )高压lOmin,冷至室温备用。5.5接种和培养：每管种一滴接种液，于370.5C恒温箱中培养72小时 *注意：接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。5.6滴定：从恒温箱中取出后，将试管中培养液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%溴麝香草酚蓝分二次淋 洗试管，洗液倒入该三角瓶中，以O.lmol/L氢氧化钠溶液滴定，呈绿色即为终点，此时PH约6.8，绘制 尼克酸标准工作曲线，用测定管得到的值，在标准曲线上查到测定管内所含尼克酸的量。*水解液的PH值调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时，不致改变基本培养基的PH值。(此乳酸菌 生长的适宜PH值为6.8)6. 计算以尼克酸标准系列的不同微克数为横坐标，滴定所需O.lmol/L氢氧化钠毫升数为纵坐标，作为标准曲线。X= (CXV/m)XFX(100/1000)X-样品中尼克酸的含量， mg/l00g；C-每毫升样品中尼克酸含量的平均值， ug/ml；V-样品水解液定容总体积， ml；F-样品试液的稀释倍数；m-试样质量， g；l00/l000-折算成每 l00g 样品中尼克酸含量， mg。7. 举例取一螺旋藻样品1.004g (m),处理后定容为100ml (V),从中取1ml稀释至25ml (F),取1 , 2 , 3 , 4ml 入试管中，加入水和培养基，高压消毒，培养，滴定，测量根据曲线分别得出四管C值为0.037, 0.073 , 0.110 , 0.136,所以四管平均值为 C= (0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4) /4=0.036。代入方程式为： X=(CXV/m)XFX(100/1000) =(0.036X100/1.004)X25X(100/1000) =8.96(mg/100g) 因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。8. 注意事项(1) 当管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug，即超过标准曲线范围时所得到的数值不能用于计算。(2) 3mol/L盐酸的配制方法：取250ml浓盐酸，加入750ml蒸馏水，共配成1L 3mol/L的盐酸(3) 试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡 1 天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清 洗干净，凉干，方可再用。尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法 (5)二、比色法1. 原理烟酸和烟酰胺于Ph=4.5下用稀NH40H提取，再与CNBr溶液与10%对氨基苯磺酸反应，测其比色值。2. 适用范围选自A0AC；适用范围：适用于药物、食物和饲料3. 仪器设备1)容量瓶，100ml2)锥形瓶250ml3)电热板4)高压釜(121C, 30min)5)离心管5ml6)漏斗7)通风橱8)酸式滴定管比色计(药物430-450nm,谷物470nm)4. 试剂所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水4.1 尼克酸标准溶液(1) 尼克酸标准储备液(100p g/ml)：将50mgUSP烟道参比标准(贮于P2O5干燥器中，放于暗处保存。(2) 标准中间液I (10p g/ml)：取少量贮备液放置至室温。用蒸馏水将10.0ml贮备液稀释至100ml。(3) 标准工作液n (4p g/ml)：将恢复至室温的贮备液2.0ml用蒸馏水稀释至50ml。4.2 其它试剂(1) 稀氢氧化铵溶液：5mlNH4OH用H2O稀释至250ml(2) 稀盐酸： V+V=1+5(3) 磷酸缓冲液(pH = 8)：将60gNa2HP047H20和10gKH2P04溶于蒸馏水中并稀释至200ml。（4）溴化氢溶液（10%，通风橱中制备）：将370ml H2O温热至40C，并加入40gCNBr。振荡至溶解冷却 并稀释至400ml。溶液在冰箱保存。*CNBr 剧毒，切勿与皮肤接触，必须在通风橱中操作。（5） 10%对氨基苯磺酸溶液：按每次1ml将NH4OH加到20g对氨基苯磺酸和170ml蒸馏水的混合液中，直 至酸溶解为止。用盐酸与蒸馏水溶液（1： 1）调节pH至4.5,采用溴甲酚绿指示剂指示。稀释至200ml。 *注：因为溶液有颜色会影响最后结果，所以稀释结束后溶液应几乎无色（6） 55%对氯基苯磺酸溶液：在55g对氨基苯磺酸中加入27ml蒸馏水和27mlNH4OH，振摇至溶解。（必要 时加温）。用NH4OH或5NHCl调pH为7,再用蒸馏水稀释至100ml。（保存在暗处）（待续）尼克酸（维生素PP,又称烟酸）的测定方法（6）5. 操作步骤5.1 样品制备（1）药物：将药品研碎，溶于蒸馏水中，稀释定容。取10mL样品于锥形瓶中，加入10mLHCl，在电热板 上加热蒸发至约2mL，冷却，加入25-50mL蒸馏水，用40%NaOH或K0H溶液调节pH值至2.5-4.5。过滤， 弃去10mL处液，转移至容量瓶中定容，使溶液含尼克酸约4p g/mL。*注：溶液的尼克酸含量应在50-200p g/mL（2） 非谷类食品及饲料：称取约28g样品，加入0.5mol/L H2S04200mL,混匀，在高压釜中121C加热半 个小时。冷却，用10mol/LNa0H调节pH值至4.5，以溴甲酚绿作外指示剂，用蒸馏水稀释至250mL，过滤。 取17g （NH4） 2SO4于50mL容量瓶中，吸取40mL样品液，用H2O稀释定容，强力振摇。过滤，混匀，取1 mL作比色测定用。如果样品中尼克酸含量为16mg/1b。最终液浓度3.2p g/mL。移取40mL标准工作液n至盛有17g （NH4） 2SO4的50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，此液含尼克酸3. 2p g/mL。*注：加入H2SO4主要是为了去除样品中的蛋白及其它杂质，以防其对测量结果造成影响（3）谷类产品：随同样品做1试剂空白和5个浓度的工作标准液。分别将1.5gCa （OH） 2放入7个锥形瓶中，移入0、5、10、15、20、25mL标准中间液I和2.5g样品（含 100p g烟酸），加入蒸馏水至90mL，振摇混匀。高压121C下2小时。趁热混匀，冷却至40C，转移至10 0mL 容量瓶中，稀释定容。从容量瓶移50mL上清液至离心管中，冰浴15min或置于冰箱中三2小时。离心15min，吸取20mL上清液至 盛有8g (NH4) 2S04和2mL磷酸盐缓冲液的离心管中。振荡溶解并温热至55-60C。离心5min,过滤。5.2 操作程序(1) 药物制剂和非谷类食物和饲料：假如10%的对氨基苯磺酸溶液, CNBr 溶液,在通风橱中用酸式滴定管 滴入，用标准工作液口，如下表制备各管：试剂 标准空白 样品空白标准溶液( mL) 1.0 1.0H2O( mL)5.0 5.0稀 NH4OH( mL)0.5 0.510%对氨基苯磺酸 2.0 2.0稀 HCl( mL)0.5 0.5样品溶液标准溶液( mL) 1.0 1.0稀 NH4OH( mL)0.5 0.5CNBr( mL)5.0 5.010%对氨基苯磺酸(mL)2.0 2.0H2O( mL)0.5 0.5*注： CNBr 有毒，注意通风每只样品都要分别制备样品空白。待续尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(7)将标准和样品移入试管中，分别加入5mL蒸馏水作为标准空白和样品空白。转动试管内的液体，立即加 入稀NH4OH，转动，加对氨基苯磺酸，再次旋转混合。立即加入0.5mL稀HCl，混匀，置于光电比色计上， 加入对氨基苯磺酸后约30s内在430和450nm波长之间任意波长调节仪器至0的A值。从加入稀NH4OH开 始按标准空白同样的方法处理标准溶液。立即转动管子，加CNBr溶液并再次转动混匀，在加入CNBr溶液 后30s后转动管子，加入对氨基苯磺酸溶液，再转动。立即加入0.5mL蒸馏水，混匀，加塞。，测量。(加 入对氨基苯磺酸溶液后1.5min时颜色最深，保留2min，然后慢慢褪色。)将样品空白设在0A,测样品溶液的A值。若标准和样品液含量大致相等，则尼克酸含量与A值成正比。(2) 谷类制品：取5只试管，其中两只加入5mL标准液，两只加入5mL样品液，另一只加入5mL蒸馏水做 试剂空白。于一只空白管，一只标准管和一只样品管各加10mL蒸馏水，将所有管置于冰中冰浴30min。对 剩下的管按顺序加入10mL冷的CNBr, 30s后加入1.0mL55%对氨基苯磺酸溶液。用标准空白在470nm处，调比色计为0A,加入对氨基苯磺酸后12-15min读出其它各管的A值。*放入比色计前，试管必需冷却一致，每管必需拭干。如管呈雾状，浸于热水中片刻，测定前拭干。6. 计算将扣除试剂空白的标准A对尼克酸含量Mg/ml作图，画出适宜的直线，从此图上求出已扣除样品空白和试 剂空白后样品校正的A所对应的浓度CoMg尼克酸/g样品=C/10ng样品7. 注意事项(1) CNBr溶液有毒，要注意安全。(2) 样品不同，处理方法不同，不要混淆。(3) 注意通风橱的通风。(4) 因为采用比色法测量，因此样品含有色素易干扰测定，影响测定结果的正确性。(5) 试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡 1 天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清 洗干净，凉干，方可再用。尼克酸(维生素PP，又称烟酸)的测定方法 (8)三、复合维生素制剂中的烟酰胺测定分光光度法1.原理在PH约4.5处将烟酰胺抽提到KH2PO4溶液中，再与CNBr和巴比士酸反应。用分光光度法测定反应产物。 烟酸含量超过烟酰胺三倍量时干扰烟酰胺测定。2.适用范围 选自AOAC；适用于复合维生素制剂检测3.仪器(1)搅拌器( 2)量筒( 3)锥形瓶( 4)高压釜(121C, 15min)分光光度计(550nm)4.试剂所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水4.1.烟酰胺标准溶液：(1) 标准储备液(250昭/mL)： 50mgUSP烟酰胺标准加60%乙醇溶解并稀释到200mL。在10C贮存。(2) 标准工作液(5gg/mL):将少量贮备液温热至室温。取出2mL用0.3%KH2PO4溶液稀释至100mL。4.2 其它试剂(1)溴化氰溶液：10%，将370ml H2O温热至40C，并加入40gCNBr。振荡至溶解冷却并稀释至400m1。溶液在冰箱保存。使用前需恢复到室温。*注：CNBr剧毒，切勿与皮肤接触，注意在通风橱 中操作。（2） 磷酸二氢钾溶液：A. 13%的磷酸二氢钾溶液：将 30gKH2PO4 用蒸馏水溶解并稀释到 1L。B. 3%的磷酸二氢钾溶液：将 3%的磷酸二氢钾溶液用蒸馏水稀释（1+9）。（3）巴比土酸缓冲液：按每批测定需用量计算，按每100mL3%KH2P04溶液加2g试剂级巴比土酸制备。 搅拌 1 小时，用前过滤。5.操作步骤5.1样品制备：取适量样品于锥形瓶中，加入0.3%的KH2PO4（KH2PO4的量至少是估计的烟酰胺量的两 倍）。若样品不易溶解，则振摇使其分散并用高压釜在121T下加热15min。用0.3% KH2PO4溶液稀释至 5yg/mL。过滤。用蒸馏水代替 CNBr 分别制备各样品的空白。将1mL工作标准液或测定液置于分光光度计比色管中。加0.5mL CNBr溶液，混匀，塞住，放置25-30mi n,加10mL巴比土酸溶液并旋摇*注：若30min后不能加巴比土酸溶液。将管置于碎冰浴中稳定CNBr反应。5.2用蒸馏水代替CNBr做为适当的空白，（550nm，分光光度计设定在0A）颜色最深时测定反应产物的吸 光度*注：加入巴比土酸后2-4min时颜色最深，稳定约1min，慢慢褪去*注：测定样品时，其放置时间不应超过30min。加入CNBr时应有规律的间隔1-2min。6. 计算样品中烟酰胺含量（mg） = （Ax5x稀释倍数）/ （Ax1000）式中A- 样品吸光度A-标准吸光度5-gg烟酰胺/mL标准工作液（结果用烟酰胺mg/片报告）7. 注意事项（1）CNBr有毒，应在通风橱中操作。（2）样品中烟酸含量超过烟酰胺含量的三倍量时会干扰烟酰胺的测定，因此样品应有明确的烟酸和烟酰 胺的含量。（3）试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放入酸缸中浸泡 1 天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清 洗干净，凉干，方可再用。