《内含子的比较》PPT课件

8.5 不同类型内含子的比较,8.5.1.1 型内含子,概念: ：1980年代初，发现原生动物四膜虫 (Tetruhymenu) 的rRNA内含子能够自我剪接(self splicing)，这一类内含子后被称作型内含子.后来在酵母菌的线粒体rRNA基因中也含有此类内含子.,发现过程为: 1980年,科学工作者将四膜虫rRNA基因克隆到质粒中，并与E.coli 的RNA聚合酶一起保温，发现转录产物除了有约400nt的rRNA内含子外，还有一些小片段。从凝胶中回收rRNA前体，在无蛋白质的条件下保温培养，单一的rRNA前体依然可形成片段更小的电泳条带，其中移动最快的是39nt的条带，测序发现，它相当于413nt的rRNA内含子中的片段。将四膜虫26S rRNA基因的一部分(第l个外显子303bp + 完整的内含子413bp + 第2个外显子624bp)克隆到含噬菌体SP6启动子的载体内，再转录该重组质粒，将获得的产物与 GTP一起保温，可以得到剪接产物，但缺乏GTP时无剪接反应，证明rRNA前体的确可以进行有GTP参与的自我剪接。,8.5.1.2 型内含子的剪接机制,(1) I型内含子剪接的过程 I型内含子剪接的第一次转酯反应，是由一个游离的鸟苷或鸟苷酸(GMP, GDP或GTP)启动的。鸟苷酸或鸟苷的3-OH亲核攻击内含子5-端剪接点的磷酸二酯键，将G转移到内含子的5-端，同时切割内含子与上游外显子之间的磷酸二酯键，在上游外显子末端产生新的3-OH。在第二次转酯反应中，上游外显子3-OH攻击内含子3-端剪接点的磷酸二酯键，将上游外显子和下游外显子连接起来，并释放线性的内含子。两次转酯反应是连续的，即外显子连接和线性内含子的释放同时进行。因此，实验不能得到游离的上游外显子和下游外显子。,第三次转酯反应是线性内含子的环化，发生在已切除的内含子片段中，内含子的3-OH攻击其5-端附近的第15和第16核苷酸之间的磷酸二酯键，从5-端切除15nt的片段，并形成399nt的环状RNA。环状RNA随即被切割生成线状RNA，由于切割位置与环化位置相同，生成的线状RNA依然为399nt。接着，再从5-端切去4个核苷酸，最终产物是395nt的线性RNA，由于这一产物比最初释放的内含子少19个核苷酸，因而被称作L19。,(2) I型内含子的结构 I型内含子剪接的最重要特点是自我催化(self-catalysis)，I型内含子的自我剪接活性依赖于RNA分子中的碱基配对。通过比较不同的I型内含子序列，发现其中有9个主要的碱基配对区域，命名为P1P9，在I型内含子中高度保守的双链结构有3个，即P1的内部引导序列(internal guide sequence, IGS)，P4的保守短序列元件P/Q，和P7的保守短序列元件S/R，其他配对区的序列因内含子不同而异。I型内含子自我剪接所需的最小催化活性中心由P3、P4、P6和P7组成。该结构包括由两个结构域构成的催化核心，每个结构域由两个碱基配对区域构成。包含上游外显子末端序列和内含子端IGS的P1，构成底物结合位点，IGS是内含子中能与外显子进行碱基配对的序列，这种配对使剪接位点暴露而易受攻击，同时使剪接反应具有专一性(图8-16)。,I型内含子的特征 1.边界顺序为5UG 3; 2.具有中部核心结构（Central core structure); 3.内部引导顺序(Internal guide seguence IGS); 4.剪接通过转酯反应（Transesterification).,8.5.2.1 II型内含子的特点 II型内含子主要存在于某些真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中，也具有催化功能，能够完成自我剪接.几乎所有的细菌II型内含子能够编码逆转录酶，并可作为逆转录转座子，或逆转录转座子的衍生物高频率插入特定区域，或低频率插入其它区域。II型内含子是由内含子靠近3-端的腺苷酸2-羟基攻击5-磷酸基启动剪接过程，经过两次转酯反应连接两个外显子，并切除形成套索结构的内含子(图8-17)。,8.5.2.2 II型内含子的剪接机制,II型内含子的5-端和3-端剪接位点序列为5GUGCGYnAG3，符合GUAG规则。II型内含子的空间结构保守而复杂，其自我剪接的活性有赖于其二级结构和进一步折叠的构象，因此在细胞内的存在受到限制。在II型内含子特有的二级结构中，有6个茎环结构形成的结构域(dld6)，在空间上靠近的d5和d6，构成催化作用的活性中心(图8-18)。,在II型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近3-端d6结构中的分支点保守序列上A的2-OH向5-剪接位点的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子1的3-OH，内含子5-端的磷酸基与分支点A的2-OH基形成2, 5-磷酸二酯键，产生套索结构，完成第一次转酯反应。接着，外显子1的3-OH亲核攻击3-剪接位点，切断3-剪接位点的磷酸二酯键，并形成外显子1与外显子2之间的3, 5-磷酸二酯键，完成第二次转酯反应。经过两次转酯反应，两个外显子被连接在一起，并释放含有套索结构的内含子。,II型内含子主要的转座事件是归巢(homing)，归巢的实质是以内含子RNA作为模板，将逆转录合成的DNA插入靶位点。逆转录反应由与RNA内含子结合的RT催化，属于靶位点为引物的逆转录(target-primed reverse transcription)。如图8-20所示，归巢反应开始于双链DNA外显子连接点上RNA内含子在靶位点的反拼接(reverse splicing)插入，这一步由RNA催化，RT协助，相当于由成熟酶协助的拼接反应的逆反应。随后，RT的En结构域在下游9 bp10 bp的位置切开DNA的另一条链，再由RT催化，以被切开的DNA链作为引物进行逆转录反应。最后，通过DNA的修复合成和连接完成内含子的插入过程。,Splicing releases a mitochondrial group II intron in the form of a stable lariat.,8.5.3 内含子剪接机制的比较,从内含子的剪接机制来看，I型内含子、II型内含子和核pre-mRNA剪接的III型内含子是相似的，只有tRNA的IV型内含子剪接机制完全不同。 I型内含子剪接与核Pre-mRNA剪接体切除内含子的主要区别是，剪接体内含子使用内含子自身的一个核苷酸，而I型内含子的剪接反应使用外源核苷酸，即鸟苷酸或鸟苷，因此在剪接过程中不能形成套索结构。 III型内含子的剪接体内snRNA的整体形态和II型内含子自我剪接时的形态类似，特别是剪接体的snRNA和II型内含子的催化部位之间的结构和功能十分相似。可以认为，这些snRNA可能来自早期自我剪接系统的II型内含子,I型内含子与II型内含子都能够完成自我剪接，不像III型内含子那样需要结构复杂的剪接体。正因为如此，I型内含子与II型内含子剪接的效率和调控远远比不上III型内含子。I型内含子的剪接反应使用外源鸟苷酸或鸟苷，II型内含子的转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷的启动，由内含子内部的腺苷酸引起，也许II型内含子剪接的效率和精确度比I型内含子更好一些。,8.6 核酶,8.6.1 核酶的发现 1982年Cech等研究原生动物嗜热四膜虫rRNA的转录后加工，发现rRNA的前体可以在鸟苷与镁离子存在下切除自身的内含子，将两个外显子拼接为成熟的rRNA分子，该反应不需要任何蛋白质类型的酶参与，因此Cech认为该rRNA前体具有催化功能，并将其命名为核酶(ribozyme). Cech和Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔化学奖。,1985年Cech等通过进一步研究，从切除的内含子中分离得到L19RNA，可参与如转核苷酸反应、水解反应、转磷酸反应等。L19RNA催化的转核苷酸反应如图8-21所示，可以看出，L19RNA既可从寡聚C切除核苷酸(图8-21和)，也可在寡聚C上添加核苷酸(图8-21和)，其催化过程具备酶的所有基本特征。,核酶作用的特点： 1，化学本质 RNA 2，底物 RNA 肽键-葡聚糖分子酶 3，反应特异性 4，催化效率低 5，产物,Reactions catalyzed by RNA have the same features as those catalyzed by proteins, although the rate is slower. The Km gives the concentration of substrate required for half-maximum velocity; this is an inverse measure of the affinity of the enzyme for substrate. The turnover number gives the number of substrate molecules transformed in unit time by a single catalytic site.,核酶的分类,8.6.3 核酶的结构 核酶的催化功能与其空间结构密切相关，已知有多种不同结构的核酶。例如，I型和II型自我剪接内含子、锤头型、RNaseP的Ml RNA、发夹型、丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus, HDV)的基因组和反基因组等。锤头型、发夹型和HDV正负链核酶均能促使自身或底物RNA裂解，产生2, 3-环磷酸酯和5-OH,锤头结构(hammerhead structure)。锤头结构包含3个茎环区以及13个保守核苷酸构成的催化中心，可以由一条RNA链回折形成(图8-22a)，也可由底物链和催化链共同构成(图8-22b)，两种形式的锤头结构都可构成如图8-22c所示的空间结构，即酶的活性中心。事实上无论自我剪切型的核酶，或者酶与底物RNA之间，只要能形成锤头二级结构，并具备1113nt的保守序列，就能在锤头结构GUN序列的3-端自动发生剪切反应。,核酶的活性部位是暴露在分子表面的一段保守核苷酸区域，无论RNA分子形成的是二级或三级结构，都使得这个区域保持一种特定的分子环境，能使自身RNA分子断裂，或者使另一底物分子的磷酸二酯键断裂，或在切割一个磷酸二酯键的同时，形成另一个新的磷酸二酯键。核酶RNA与底物RNA之间的相互作用依赖于碱基配对，形成一种催化环境。,核酶是一种金属离子依赖酶,金属离子的结作用： 特异的结构作用或参与活性部位的化学过程 促进RNA整体折叠 二价金属离子（Mg2+)与底物活性部位直接相互作用或参与过渡中间复合物的产生,