pcr中GC含量过高的问题

PCR 中 GC 含量过高的问题DNA molecule: 4849Length = 1212 base pairsMolecular Weight = 370809.00 Daltons, single strandedMolecular Weight = 741128.00 Daltons, double stranded G+C content = 70.96%A+T content = 29.04%NucleotideNumberMol%A17314.27C43836.14G42234.82T17914.77解决：1由于基因中GC含量过高，就不应该用普通的buffer 了，而应该用特殊的-GC buffer ，对于 TM 值可以做一下梯度 PCR， GC buffer 可以在一些公司都 能买到。买TAKALA的GC buffer for PCR.还有，设计一段合适的引物确定 你模板中确实有你的目的片段也是很有必要的。2只是为了 PCR获得基因的话，你可以尝试用68度/94度这种两步PCR法，3. gc 含量是有些高，建议你换一种保真性比较高的酶(建议还是不要用 japan 公司的)，现在有好多高保真的酶(sigma的jumpstart taq et al)都可以扩增 高gc的模板；另外，DMSO也是一种办法，但是，这种办法需要你凭经验确 定加入的量，一般来说 5%已经足够了，最好不要超过 10%，因为过高的 DMSO反而会一直taq酶对per的特异性扩增。4. 用 Takara 的 long-Taq with GC buffer 效果很好。我做的是链霉菌，所以 GC 含量也在70多。我P的效果很好5. 可以试着加点DMSO、NaOH、甘油等东西试试。以解除其二级结构的影响，当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.6.女口果实在不行，就用 adva ntage 2 high GC taq polymeras. (cl on tech),效果 好，就是贵了点。可以用双温法试试，比如35个循环，总变性之后，前五个循环双温即没有延 伸，后三十个循环三温，具体温度根据引物Tm值定。我试过效果不错。如果基因的5端含有丰富的GC碱基，设计的PCR引物Tm值很高，用普通 PCR很难理想地扩增出此基因。用热启动(hot start)和降落-PCR,能取得了 较好效果。在PCR开始时加入Qiagen公司的Hotstar Taq DNA聚合酶，并延 长起始变性时间如95C变性15 min,能使模板DNA完全变性，以便提供最大 数量的引物配对位点，可避免引物二聚体和非特异性配对。PCR反应过程中， 首先在高于引物Tm值的72C左右扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两 引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证 第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物 的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩 增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地 位。因此，降落-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。为你设置循环条件为：95C变性15 min；94C 45s，72C 30s，退火温 度每循环降低2.0C，72C 45s，5个循环；94C 45s，设置退火温度梯度 从 55C到 65C 30s，72C 45s，30 个循环；72C延伸 10min。几点建议：先优化反应条件，GC丰富的序列，退火温度其实也不用刻意加高主要是变性温度，预变性96度5分钟然后再加酶(热启动) 一般循环的变性温度用95度比94好，还不行还可以再加高 还有DMSO和甘油，各加到5%就足够了，光加DMSO有的时候会使酶的半衰 期下降引物GC含量分别高达70%以上时，用普通PCR很难理想地扩增出此基因。因 为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难打开，在常规变 性温度下，DNA模板变性不完全，同时由于单链的G+C丰富区易于自身互补 配对形成稳定的发夹环二级结构，而使PCR引物难于结合到模板上，DNA聚合 酶也难于延伸或停止延伸，结果常出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶 基因。在扩增高含量GC的基因时，可对PCR条件进行几个方面的优化：1、热启动(hot start) PCR：使用热启动PCR，一方面通过扩增前的加热，使 双链模板充分解链，另一方面，通过高温启动反应，促进引物的特异性复性与 延伸；增加有效引物的长度，提高了反应的特异性与灵敏性，并减少了引物二 聚体或多聚体的形成，从而能提高GC富集区的扩增效率。我们采用Qiagen公 司提供的Hotstar Taq DNA聚合酶，此酶含有一种热不稳定性保护抗体(Taqstart antibody)，该抗体在低温时与Taq酶结合，抑制其活性，当反应 体系达到一定的温度后，这种热不稳定性保护抗体就从Taq酶上脱落下来，Taq 酶得以恢复活性。我们在PCR开始时就加入Hotstar Taq DNA聚合酶，并延长 起始变性时间如95C变性15 min,能使模板DNA完全变性，以便提供最大数 量的引物配对位点，避免了引物二聚体和非特异性配对。2、降落(TD) -PCR： PCR开始时的退火温度高于估计的Tm值，随着循环的 进行，退火温度逐渐降到Tm值并最终低于这个水平。退火温度选择应根据引 物的长度及G+C的含量，在Tm值允许的范围内，较高的退火温度可大大减少 引物和模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。首先在高于引物Tm值 的温度扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后 的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生 在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温 度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增， 在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，TD-PCR既能增 加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。3、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、模板等也影响PCR的产量及产物特异 性。它们的浓度过高反应特异性降低，过低则PCR产物产量减少，即高特异的 反应条件可能与高产量的反应条件并不一致。2、TransStart FastPfu Fly dna Polymerase 特点：（1）新型热启动；（2）快速扩 增；（3）咼保真性；（4）强扩增能力；（5）咼灵敏度；（6）咼产量；适用范 围：1.扩增高GC含量、具有二级结构等复杂模板。2高保真扩增，基因克 隆，基因定点突变等。3长片段扩增。3、当然，也可以尝试对模板进行预变性，如加入适当的NaOH处理模板；8.如果GC buffer +LA扩不出还可以考虑用TaKaRa的PrimerStAR虽然有广告嫌 疑，虽然不喜欢R货。但是确实好使，我有几个片段在3k作用，GC含量 70%+，用gc buffer I和II都试过不好使，后来用primerstar 68两步法扩出 来了9. NEB现在有两种DNA聚合酶适合扩增高GC含量的片段：1.One Taq DNA聚合酶，非常适用于扩增高GC含量或者复杂模板的DNA，其 中含有GC Buffer，并且还有GC Ehancer,方便您的使用，并且有DMSO可以 供选择使用，该聚合酶的扩增长度为6kb,保真度为Taq酶的两倍；2.Phusion超保真DNA聚合酶，也提供GC Buffer，该聚合酶的保真度是Taq 的50倍，可以扩增长度为20kb的片段，扩增效率高；您可以了解相关信息，请您参考。