核移植技术与动物克隆.ppt

第八章 核移植技术与动物克隆,Nuclear transplantation Animal Cloning Technology,Nuclear transplantation Animal Cloning Technology, What 技术原理 How 技术方法 Why 技术应用,细胞拆合与重组概述,1、细胞拆合技术的发展概况 1952年Briggs 和King首创了核移植的方法 1967年Careter发现细胞松驰素B能诱发体外培养的小鼠成纤维细胞的排核作用 1972年Prescott等首先应用离心结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功 细胞核、质分离技术与细胞融合技术汇合起来，建立了细胞重组技术,胞质体（cytoplast）：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞，由细胞松弛素B处理后，经离心得到。 核体（karyoplast）：由胞质体分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜的结构。 胞质杂种细胞：将胞质体和另一完整细胞融合得到的细胞。 杂种细胞：核体与完整细胞融合。 重组细胞：核体与另一种细胞的胞质体融合。,1、2、3亲本细胞 4、6核体 5、7胞质体 8、9杂种细胞 10重组细胞 11胞质杂种细胞 PEG介导 筛选,2、细胞拆合与重组的概念,（1）细胞拆合: 把完整细胞的细胞质和细胞核用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组织起来，培育新的细胞或新的生物个体,（2）细胞重组（cell reconstruction),将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介子的诱导下，使胞质体与完整细胞合并 ，或胞质体与核体重新组成，构成细胞的过程,3、细胞拆合的方法,（1）物理拆合法 用紫外线或激光将核破坏，再用微玻璃针或微吸管将其他细胞核注入（最早使用） 将细胞融合技术与显微外科手术结合，作微吸管将细胞核连同周围少量细胞质吸出，再注入已去核的细胞中,显微操作法进行细胞核移植,（2）化学拆合法, 细胞松驰素（Cytochalasin）B 结合高速离心 CB阻断细胞质分裂，不干扰核分裂；引起细胞表面形状的改变和排出细胞核。,机理：CB是真菌的一种代谢产物，可以切断微丝，并结合在微丝末端阻抑肌动蛋白聚合，但对解聚没有明显影响，因而可以破坏微丝的三维网络！,一、核移植 核移植供体 核移植受体 核移植方法 激活、培养与胚胎移植 二、动物克隆 基本方法 克隆羊“多莉”的培育 三、现状与前景,第五章 核移植技术与动物克隆,核移植技术与动物克隆原理和方法,将受体卵细胞 去核（？）,向去核卵细胞植入（？）供体细胞（？）,移植后的细胞激活后可以象受精卵一样发育形成动物个体，并具有与核供体细胞相同的基因,第二代试管婴儿, 卵母细胞胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection， ICSI), 核移植？,第四代试管婴儿, 借助别人卵浆增强自己卵子活力 特征：卵浆置换 主要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性, 核移植？,一、核移植技术,1、核移植供体, 胚胎、胎儿细胞胚胎细胞核移植 胚胎卵裂球、干细胞和胎儿成纤维细胞等 体细胞体细胞核移植, 完整的二倍体，含供体动物的完整基因组 在受体细胞质环境中，完成分化过程的倒转（重编程reprogram），能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程,如何获取供体细胞核？, 显微操作 细胞松弛素结合高速离心 核体 胞质体,2、核移植受体细胞, 去核卵母细胞（收集方法？）, 细胞体积较大 决定细胞向某一方向分化的初始信息储存于卵细胞中,受体细胞的种类：卵母细胞、受精卵、2-细胞胚胎。 其中卵母细胞最为普遍。作为核移植受体的处于第二次减数分裂中期（MII）的卵母细胞可以经超排卵或体外成熟培养的卵巢细胞得到,如何给受体细胞去核？, 显微操作 细胞松弛素结合高速离心 紫外照射,3、核移植的方法, 去核卵细胞胞浆内显微注射 核体透明带下注射，再刺激核体与胞质体融合,4、移植后重组细胞的激活、 培养、胚胎移植, 激活 （使卵母细胞从M II 期解放，转到“受精”状态） 重组胚的体内或体外培养 胚胎移植,重构卵的激活,正常情况下,受精过程中，精子进入卵子后,卵母细胞质中会出现一系列的反应,如游离Ca2+ 浓度增高、母源性的mRNA启动转录、MPF等因子活性下降等。这些反应是卵母细胞被激活的标志，不经过这些变化,胚胎就不能正常发育。 核移植过程中的激活就是模仿受精过程中精子的刺激作用。 目前，激活的方式主要有：电激活和化学激活 重构胚移入受体之前的培养方法有体外培养和体内培养两种方法。, 核移植成功的重要前提,尽量保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期 （同步状态） Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer,如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？,一、核移植 核移植供体 核移植受体 核移植方法 激活、培养与胚胎移植 二、动物克隆 基本方法 克隆羊“多莉”的培育 三、现状与前景,第五章 核移植技术与动物克隆,克隆来源于英语“clone”或“cloning”的音译，起源于希腊文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插条”繁殖。曾译为无性生殖或无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂而形成的纯细胞系，这个细胞系每个细胞的基因彼此是相同的。,随着分子生物学的发展，通过核移植与基因工程等技术也可获得无性系，于是人们把实现无性繁殖的操作称之为克隆，克隆由名词转化为动词。 克隆=复印 1997年3月WHO解释：克隆为遗传上同一的机体和细胞系（株）的无性生殖,动物克隆发展简史（略）,爪蟾的核移植实验,1958年 John Gurdon和Machineer,认为：细胞分化并不需要遗传物质的不可逆修饰！,1970 年 John Gurdon,蛙蹼角质化细胞,鱼类的核移植, 从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响 1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。,核移植小鼠（1981年1月Science杂志）,哺乳类的细胞核移植,问题： 除了核移植外，还有其它克隆动物的方法吗？,1、哺乳动物克隆的基本方法：,利用胚胎分割或卵裂球分离技术从2个细胞至胚胎的的早期胚胎产生两个或两个以上的个体 通过细胞核移植构建新的重构胚或重建胚。,2、克隆羊多莉的培育,问题： 3个母亲克隆出多莉，3只公羊能克隆出一只小公羊来吗？ 多莉100是白面绵羊的复制品吗？ 如何做到100复制自己（雌性、雄性）？,问题： 体细胞核移植时，,如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？,核全能性的恢复（重编程）？,血清“饥饿”法,实验成功的关键：血清饥饿,使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段 使结合在基因（DNA）上的调控蛋白脱落下来 重新编程（reprogram, remodel ）,返回, Three categories of cells in vivo, Cycling cells Dividing continuouslyStem cells, G0 cells Do not divide normally, but divide when given an appropriate stimulus: liver cells, lymphocytes,Terminally Differentiated cells Highly specialized, have lost the ability to divide until they die: muscle cells, red blood cells, nerve cells,试验结果,424只成体绵羊细胞核移植 277个融合细胞（63.8%） 移入母羊输卵管成功247个（89.2%） 发育到桑椹期的胚胎29枚(11.7%) 植入13只母羊子宫后 1头羊怀胎产出 总成功率0.23%,一头全白的小羊羔，依偎在生下它但与它毫无血缘关系的代育母亲一头苏格兰黑脸羊旁边，这张著名的照片向世人显示，生物技术的新时代来临了。,多莉羊之父 威尔穆特,多利羊（Dolly)风暴,1997227 Nature （385：810813） 英国爱丁堡罗斯林研究所 伊恩威尔穆特小组： 多利羊1996. 7 出生1996. 11 收到文章1997. 2 文章发表,多莉羊成为明星,多莉和它的三个孩子,问题： “多莉”是第一只克隆成功的动物吗？ 为什么她的诞生会引起轰动？,第一只体细胞克隆成功的哺乳动物！,问 题,在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？,对传统理论的挑战,对于动物来说，随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化能力 全能性多能性单能性分化成熟的体细胞,一条科学成就的宣布，在全世界范围内，短短几十天左右时间，从学术界到经济界、政界引起巨大而深刻的反响，是空前的 “克隆”一词也顿时变得妇孺皆知,多莉在全世界引起的巨大反响,一方面学术界高度评价 1997. 3. 2 美国华盛顿邮报 奥勒冈州沃尔小组：成功克隆两只恒河猴（96. 8出生） 1997. 3. 5台湾地区吴明杰小组：5只克隆猪,沃尔小组成功克隆两只恒河猴,吴明杰小组：5只克隆猪,在日本克隆成功的牛,多莉在全世界引起的巨大反响,另一方面，人们马上意识到克隆人的威胁 政界纷纷出来表态 1997.3.4 （美）克林顿总统宣布：禁止联邦政府资助人体克隆实验 1997.3.5 （意）卫生部长在众议院宣布：禁止人体和动物克隆,1998年月，美国一位名叫理查德锡德的科学家率先提出，他将进行克隆人试验，目的是为患不育症的夫妇繁衍后代。此言一出，举世震惊。,1998年,1998年初提出要克隆人的美国医生锡德（Richard Seed）折腾了几 年，也不知是手艺不到家还是没钱，还是根本就只是举起刀叉装装样子，没打算真把螃蟹吃下肚，又或者是被各路高人骂怕了，总之一直不见 他动真格的。,2001年8月7日，美国科学院关于克隆人问题的讨论会上，三位表示要克隆人的科学家。 左：意大利国际联合研究所（International Associated Research Institute）所长Severino Antinori 中：克隆援助（Clonaid）公司老板Brigitte Boisselier 右：美国肯塔基大学教授Panayiotis Michael Zavos 他们克隆人的目的都是为了给不孕的夫妇培育后代。,“克隆三疯子”,“科学三狂人”,“雷尔”教派克隆婴儿的妇女,2001年,问题三： “多莉” 克隆成功（即哺乳动物体细胞克隆成功）说明了什么？,核的全能性？,A. 理论意义,证实分化成熟的动物细胞核仍具全能性 证实细胞质对胚胎发育分化的决定性,看来，分化的关键在于细胞质？细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。,细胞质中的分化决定子,后来实验证明，细胞质中的分化决定子，是 RNA。它们对紫外线敏感，对 RNase 敏感 在卵子形成过程中，卵母细胞中含有 25 万种 mRNA，每种约 600个拷贝。这些 RNA 构成母体信息，决定受精卵的发育潜能,信息体（informasome）,在卵子中，母体信息以核糖核酸蛋白（RNP）颗粒形式存在，其沉降系数比核糖体还大，称为信息体,B. 实践意义,为实验室研究和动物的药物实验提供遗传上完全一致的实验动物 控制动物的性别 拯救濒危动物 提高转基因动物的效率 使经遗传改造的猪为人类提供移植器官 生产基因工程药物和基因疫苗 如：蛋白质多肽类药物 (胰岛素、凝血子、干扰素、生长因子)2000年产达到185亿美元,2003年2月15日早晨的罗斯林研究所,一、核移植 核移植供体 核移植受体 核移植方法 激活、培养与胚胎移植 二、动物克隆 基本方法 克隆羊“多莉”的培育 三、现状与前景,第八章 核移植技术与动物克隆,应 用,A 生产实践（结合干细胞工程、胚胎工程）： 制备转基因动物，用于药物生产 优良畜种的培育和扩大繁殖 开展异种动物克隆，拯救濒危动物 治疗性克隆研究 B 理论研究核质关系问题,克隆人的技术路线与步骤,目前已经克隆出的动物,动物克隆技术存在的问题,1、营养过多发育过快，克隆动物一般都有发育过快的问题，体外培养的时间过长或培养液的成分可能与克隆动物的流产以及出生后不久死亡有关,2、线粒体问题 目前还不知道原本就存在于卵子里的线粒体到底在多大程度上与个体的性质有关，细胞核的遗传基因与线粒体的遗传基因相互影响的问题必须引起重视,3、核的重新编程不完整，染色体倍数不正确、性别等都可能对克隆动物的质量产生影响，因为目前所得到的体细胞克隆动物大多为雌性，因此性别可能对体细胞克隆的成功率一定的影响。 4、端粒问题争论颇多,动物克隆技术存在的其他问题,体细胞克隆后代有可能出现老化现象 动物克隆的理论研究跟不上技术发展的步伐 总体成功率处于1%-5%的较低水平 克隆技术研究本身需要与其他学科和技术进行更为广泛的渗透与融合 克隆产生的后代，基因组成单一，失去对复杂环境变化的适应潜力,生殖性克隆,将核转移后激活的卵细胞植入到生殖道中，可以发育为一个新的个体，并与核供体具有相同的基因型，如图示,去核,卵细胞去核,母体,提供细胞核,激活卵细胞,植入生殖道,发育成个体,子代和母代完全相似,治疗性克隆原理,胚胎干细胞具有全能性，可以分化形成多种组织，从而替代人体坏损组织。通过核移植技术得到的胚胎干细胞不仅可以避免使用人类胚胎的伦理问题，还能使用病人的细胞核获得组织配型相似胚胎干细胞，避免了移植细胞和组织的免疫排斥。,供体细胞核的来源,体细胞核移植,胚胎细胞核移植,胚胎干细胞核移植,核移植目的,生殖性克隆,治疗性克隆,核 移 植 分 类,电视短片：克隆危机,作 业,简述异种克隆大熊猫的可能基本过程及各步骤的主要原理？,精卵结合,胚 胎,细 胞,个 体,参考文献：,