氧的供需及对发酵的影响

7.4 氧的供需及对发酵的影响,溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。,在28氧在发酵液中的100饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。,7.4.1 微生物对氧的需求,一、描述微生物需氧的物理量,比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌-1h-1,摄氧率(OUR，r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1,X : 菌体密度, g菌/L,二、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响,cCr,QO2,cL,cCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度, 一般用空气氧饱和度表示。,一般对于微生物： CCr: 115%饱和浓度,例：酵母 4.6*10-3 mmol.L-1, 1.8% 产黄青霉 2.2*10-2 mmol.L-1, 8.8%,定义：临界溶氧浓度临界时发酵液中氧的浓度/ 氧饱和度,所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧浓度 不低于临界氧浓度即可,问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足,例：以微生物的摄氧率0.052 mmol O2L-1S-1 计， 0.25/0.052=4.8秒( 0.25 为溶解氧浓度),注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样：,头孢菌素 卷须霉素 生长阶段 5-7% (相对于饱和浓度） 13-23% 产物合成 10-20% 8%,在菌体生长和产物合成阶段, 并非溶解氧浓度越高越好,卷须霉素发酵时,在40-140 h 维持氧在10% 比在 0 或45% 时的产量都要高,过高的溶氧对菌体生长有害, 主要原因可能是新生O, 超氧化物基 和过氧化物基 ,或羟基自由基 对菌体组分的破坏,三、影响需氧的因素,菌体浓度,QO2,遗传因素,菌龄,营养的成分与浓度,有害物质的积累,培养条件,7.4.2 反应器中氧的传递,一、发酵液中氧的传递方程( 氧的溶解情况),CL,Ci,P,Pi,气膜,液膜,N：单位接触面积传氧速率 kmol/m2.h kg: 气膜传质系数 ;kmol/m2.h.atm KL: 液膜传质系数 m/h,气液界面: 氧从气膜到液膜,C* : 与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度,KL : 以氧浓度为推动力的总传递系数 (m/h) c* : 氧在水中的饱和浓度mmol/ L 所有能增加以上两指标的因素都能改善供氧,再令：单位体积的液体中所具有的氧传递面积为 a (m2/m3),Nv：体积传氧速率 kmol/m3.h KLa: 以(c*-c)为推动力的体积溶氧系数 h-1,二、发酵液中氧的平衡,发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中,消耗：OUR= QO2 .X,氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度上面,三、供氧的调节,cL有一定的工艺要求，所以可以通过KLa 和c*来调节 其中c*P/H P : 氧分压 H :亨利常数, 与温度及液体中固形物质的浓度有关,Nv,H,P,KL a,调节KLa是最常用的方法， KLa反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。,45升 1吨 10吨 搅拌速度 250 rpm 120 120 供氧速率 7.6 10.7 20.1,7.4.3 影响KLa的因素,KLa反映了设备的供氧能力，发酵常用的设备为摇瓶与发酵罐。,一、影响摇瓶KLa的因素,为装液量和摇瓶机的种类,摇瓶机,往复，频率80-120分/次，振幅8cm,旋转，偏心距25、12, 转速250rpm,装液量，一般取1/10左右： 250ml 15-25 ml 500ml 30 ml 750ml 80 ml,例： 500 ml 摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响 装液量 30 ml 60ml 90ml 120ml 酶活力 713 734 253 92,1、理论上分析,KLa,n：转速,d：搅拌桨直径,通气量,A. 提高搅拌，调节KLa的效果显著,二、影响发酵罐中KLa的因素,提高搅拌增强溶氧系数的原因,搅拌能把大气泡打成微小气泡, 增加了接触面积, 延长了接触时间(小气泡上升慢),搅拌使液体作涡流运动, 延长了气体在罐体内上升的时间,搅拌使液体呈湍流运动, 减少了气泡周围液膜的厚度,搅拌使菌体分散, 增加了接触面积, 有利于氧的传递,过度剧烈搅拌产生的剪切力很大, 要考虑到对细胞尤其是菌丝体的损伤,B. 搅拌器,类型: 轴向式( 桨式, 锚式, 框式, 推进式) 和径向式(涡轮式) 圆盘涡轮式的溶氧效果最好, 主要产生径向液流, 但不利于罐内液体的混合 因此, 下组用圆盘涡轮式搅拌打碎气泡, 上组用平浆式搅拌混合料液,叶径d :,相对位置: 下组搅拌器离罐底0.8-1 d 较好, 两组搅拌器之间的距离也要仔细考虑,搅拌器的组数:,C. 空气线流速,空气线速度过大时, 会发生”过载”现象, 即浆叶不能打散空气, 气流形成大气泡在浆的周围逸出,例 某一产品的发酵 d n c 产量 450 180 20% 4978 450 280 40% 5564 550 180 60% 8455,例 黑曲霉生产糖化酶 n 230 230 270 通气比 1:0.8 1:1.2 1:0.8 产量 1812 2416 2846,提高d、n显著提高c , 提高了产量,提高N, 比提高Q有效,D. 空气分布器,E. 液体的粘度,空气分布器的类型, 喷口直径, 管口与罐底距离,影响气泡的大小, 稳定性和氧的传递效率,F. 氧分压,增大罐压或增大通入气体中的氧分压(如通入纯氧),G. 发酵罐内液柱高度,经验: H/D 从1 增加到2, KLa 可增加40%; 从2增加到3 , KLa 增加20% . 一般以2-3为宜,H. 发酵罐体积,大罐氧利用率高 相同几何形状的罐体, 体积大的氧利用率可达7-10%; 而体积小的只有3-5%,2、实际上：,对于转速的调节有时是有限度的,通风的增加也是有限的,蒸发量大,中间挥发性代谢产物带走,例：红曲霉生产色素用于食品工业，静止培养改为通气培 养，比色法测定产量：,通气 0(静止) 1.4 2.0 3.1 6.8 19.5 OD 0.28 0.7 8.3 15.6 14.3 6.2,提高,下降,所以这些因素的存在，发酵设备的供氧是有限的,3、小型发酵罐和大型发酵罐调节KLa的特点,小型发酵罐，转速可调,大型发酵罐，转速往往不可调,大型反应器的合理设计,对现有设备一定要注意工艺配套,7.5.4 CL、OUR和KLa的测定,一、CL的测定,1、碘量法,2、溶氧电极,极谱型(阴极)：,O2+2H+2e H2O2,原电池型(阴极)：,O2+2H2O+4e 4OH-,测定：一般是得到相对值,二、OUR的测定,1、物料衡算,流量（进口空气中氧的氧含量出口空气中的氧含量） OUR= 发酵液体积,氧的浓度：氧分压仪,停止供气：,dCL = -OUR dt,用溶氧电极测定OUR，要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化 测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：,i饱在饱和氧浓度C*时的电流值 i残氧浓度为零时电极所具有的电流,2、溶氧电极,若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也不断下降,t停止供气后CL下降到最低点时所需时间 i在t时间内的电流变化,三、KLa的测定,1、亚硫酸盐法（冷膜）,氧 亚硫酸钠的氧化,KLa.C* = 亚硫酸浓度的降低,Cu2+ 2Na2SO3+O2 2Na2SO4,2、平衡法,OUR KLa= C*-CL,例：一个装料为7L的实验室小罐，通气量为1VVM（标态），发酵液的CL25%、空气进入时的氧含量为21%，废气排出的氧含量为19.8%，求此时菌体的摄氧率和发酵罐的KLa,式中C*可以查得，CL可以用溶氧电极测得，OUR也可算出，因此可求得KLa值,待溶氧到最低点后再恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线,用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平线,这时停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢,3、动态法,CL/t=KLa(C*-CL)-OUR CL=-1/KLa(CL/t+OUR)+C* 将CL对CL/t+OUR作图，得到一条直线，斜率为-1/KLa因此可求得KLa，延长直线与纵坐标相交点为C*,溶解氧浓度随通气变化的情况,KLa的求取,OUR,OUR,7.4.5 溶氧浓度的变化及其控制,一、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定KLa下）：,OUR,X,Q,CL,一般有一个低谷，在对数生长的末期,二、发酵过程中溶氧的控制,1、溶氧控制的策略,微生物反应:,X S P+ X,=a+b,菌体生长期：,酶系统 ,酶系统 ,关键因子,开始的细胞,长好以后的细胞,产物合成,产物形成期：,底物,产物,酶系统 ,反应动力学问题,发酵过程的控制一般策略：,前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成,溶氧控制的一般策略：,前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成。,2、溶氧控制的实例,GA,X,DO,谷氨酸发酵：,要求：氧饱和度1,控制：0-12小时 小通风 12小时后 增加通风,原因：0-12小时菌体量较小，采用小通风,12,一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。,例： 生产肌苷酸： 通气量不变 17.15 mg/ml 24小时增加 22.55 mg/ml 30小时增加 18.25 mg/ml 36小时增加 12.34 mg/ml,例: 溶氧在青霉素发酵控制中的应用,控制的原则: 加糖速率正好使培养处于半饥饿状态, 即仅能维持菌的正常生理代谢, 而把更多的糖用于产物的合成.,三、发酵过程中溶氧浓度监控的意义,1、考察工艺控制是否满足要求,2、其它异常情况的表征 染菌、噬菌体、设备和操作故障,3、间接控制的措施,染菌后可能出现异常”跌零”; 也可能出现溶氧升高,搅拌停止,溶氧降低; 加油过量, 溶氧降低;,作为质量控制的指标: 如天冬氨酸发酵, 酵母发酵中好气转为厌气培养的时机是关键,小节：,了解微生物对氧的需求并掌握其中的基本概念,掌握反应器氧的传递方程，及其参数的测定,深入理解KLa的意义，了解反应器放大的基本概念,掌握发酵过程中溶氧浓度的调节方法，并认识监控 溶氧浓度的意义,