本科生生物化学实验电泳技术原理

电泳原理与技术,移动界面电泳(moving boundary electrophoresis) 区带电泳(zone electrophoresis) 稳态电泳(steady state electrophoresis),其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。,依据技术原理，电泳可分三种形式:,任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道，在一定温度、pH条件下、稳定的静电场中实现对样品中蛋白质的分离，进而进行分析。,电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。,常见凝胶电泳的支持介质：,聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG)由丙烯酰胺和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成。未交链的单体丙烯酰胺属神经性毒素，并具有致癌作用，实验过程注意尽可能避免中毒。实验过程简单，仪器设备叫贵重，但分辨率很高，重复性强。主要用于蛋白质、酶、小分子核酸等分离分析。,琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接的-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D吡喃半乳糖交替形成。试剂昂贵，方法简单，分辨率较高。主要用于DNA分离分析。,淀粉凝胶：15%淀粉凝胶作为载体可对一定分子量的蛋白质进行有效分离。成本低，简单。主要用于同工酶等分离分析。,一、醋酸纤维薄膜电泳,1.操作技术要领：,(1).醋酸纤维薄膜前处理,(2).点样：点样23l；点样量多少直接影响分离效果，控制点样量是试验成功的关键。点样位置合理：距离薄膜一端约2cm样线上平行点样，23个样点基本保持在一条线上。,商品薄膜在pH8.6巴比妥缓冲液浸泡1h以上。取出后，小块滤纸对折吸取薄膜表面多余的缓冲液，进行点样。,(3).醋酸纤维薄膜置于电泳槽,样点一端贴阴极盐桥(黑线端)，非点样端置于阳极盐桥(红线) 排除气泡压实(确保薄膜与电极接触良好)。,(4).电泳：80100V；3550min。,pH8.6巴比妥缓冲液,培养皿,醋酸纤维薄膜,-,+,点样线悬空切勿接触(近)滤纸,(5).染色,薄膜浸泡于氨基黑溶液中510min。,(6).脱色,薄膜浸泡于漂洗液中进行漂洗，至背景为乳白色。,(7).薄膜干燥,(8).透明,薄膜浸泡于透明液中1030s，及时取出贴于干净玻板上，排气泡。慢加热，逐步烘干。,(9).分析,薄膜从玻板上取下，进行分析。,Alb(清蛋白),-球蛋白,-球蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,薄膜置于烘箱完全干燥。,-,+,Alb(白蛋白),-球蛋白,-球蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,各组分构成,白蛋白,1-酸性糖蛋白；1-抗胰蛋白酶；,HP；CP；-巨球蛋白；脂蛋白；,转铁蛋白；补体系统；脂蛋白,IgG；IgM；IgA；IgD；IgE,正常参考值,Alb：57%68%,1：1.0%5.7%,2：4.9%11.2%,：7%13%,：9.8%18.2%,凝胶成像系统拍照及扫描分析结果,2.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白质原理,Alb(白蛋白),-球蛋白,-球蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,4.64,5.06,5.06,5.12,6.857.3,69,200,300,90150,156950,-,+,在pH8.6条件下血清中哪种蛋白质在电场中向阳极移动最快？,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,分子量相同时，带负电荷越多者移动较快；相同等电点时，分子量较小者向异极移动较快。,1比2球蛋白分子量小，向阳极移动快！,Alb(白蛋白),-球蛋白,-球蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-,+,%,57-72,2-5,4-9,6-12,12-20,polyacrylamide gel electrophoresis,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),不同蛋白质由于带电性质、分子颗粒大小及形状不同，在聚丙烯酰胺凝胶(PAG)中，向异极泳动速度快慢不同，经过电泳最终被分开。由于蛋白质在凝胶系统分离过程中存在浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此，PAGE法是分离、分析蛋白质较好的技术方法之一。,（一）PAGE技术流程简介,2.制胶,1.组架,3.点样,4.电泳,5.染色,6.脱色,7.分析,玻板,胶条,U型玻板,封胶,分离胶溶液,浓缩胶溶液,插入梳子,电极缓冲液,电极缓冲液,通常采用过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以N,N,N,N-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。其结果是液态转变为逐步胶凝的半固体状态。凝胶形状取决于模具。,（二）丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构,甲叉双丙烯酰胺,+,丙烯酰胺,胶联单体,胶联剂,过硫酸铵,TEMED,聚丙烯酰胺凝胶,具备立体的网状结构,立体的网状结构中网眼大小与凝胶浓度相关:,胶浓度T=,胶联度C=,a:丙烯酰胺(单体)的量(g),b:甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的量(g),m:a+b所在缓冲溶液总体积(ml),凝胶内均匀的立体的网状结构示意图,凝胶中网眼的大小与胶的浓度有关，胶的浓度越小，其网眼越大，胶的浓度越大网眼越小。一般常规胶浓度为8%-10%。分离分析较小的蛋白质分子时用较高浓度的凝胶，而分离分析分子量较大的蛋白质时则用较大浓度的凝胶。,凝胶浓度与有效分离蛋白质分子量之间的关系,分离胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置； 分离胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子受到的分子筛效应减小，不能得到很好的分离；因此实验过程需要根据样品中被分析的蛋白质分子大小适当进行设计。,引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在4060分钟内完成。,系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果；,温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性； 分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；,（三）影响凝胶聚合速度主要因素,（四）PAGE分离蛋白质原理,PAG系统电泳分离蛋白质具有很高的分辨率，因为该系统工作状态下存在三种效应，这三种效应与凝胶系统pH不连续性及凝胶网眼大小有关。,1.浓缩效应,电极缓冲液Tris-HCl(pH8.5)浓缩胶为的pH6.5，通电后样品中的各种带负电荷的蛋白质会在快离子(Cl-)和慢离子形成的高压带之间初步分开并形成很窄的条带，而整个样品中的蛋白质在将进入分离胶时会形成一条细线，即被浓缩之效果。,2.电荷效应,3.分子筛效应,样品,甘氨酸缓冲液,浓缩胶(网眼大),甘氨酸缓冲液,分离胶(网眼小),pH8.5,pH6.5,pH8.9,玻板组成的三明治模具(1mm厚),电泳槽,2.电荷效应,3.分子筛效应,在设置好的浓缩胶及分离胶特定pH条件下，不同蛋白质所带电荷多少不同，并在稳定的静电场中向异极泳动的动力所决定的泳动速度不同，最终会被分离。,分离胶内属于立体的网状结构，分子量较大的蛋白质颗粒向异极泳动受到的阻力较大，泳动较慢，而分子量较小的蛋白质则阻力较小，向异极涌动较快，最终被分开。,（五）影响蛋白质泳动速度及分离效果主要因素,1.系统的pH值,凝胶体系及电极缓冲液的pH决定样品中蛋白质的带电性质，直接影响蛋白质的电泳方向和泳动速度。pH一般设置成大于样品中蛋白质的等电点，蛋白质均荷负电，电泳方向朝阳极。而当pH小于样品中蛋白质的等电点时，则所有蛋白质分子荷正电，静电场中向阴极泳动。前一种电泳系统属于碱性电泳，后者成为酸性电泳。,2.电场强度,普通电泳,高压电泳,520V/cm电压降(电位梯度)。,70200V/cm电压降(电位梯度)。,直接影响蛋白质泳动速度的主要因素。,3.温度,电泳过程中由于电流作用致使凝胶发热，热效应对电泳有很大影响。温度升高时介质粘度下降，分子热运动加剧，自由扩散变快，有效迁移率增加，但对于蛋白质分离不利。另外较高温度会使凝胶变形，分子筛效应降低，影响分离。因此，一般要求在15-25之间进行电泳效果较好。,4.电渗作用,电泳介质或支持物(如凝胶)在电极缓冲液中吸附带电离子，使溶液相对带电，进而在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这种想象称为电渗现象。带电溶液的移动会影响蛋白质的泳动。,sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),蛋白质受还原剂作用解开二硫键，同时受SDS作用处于变性状态，在聚丙烯酰胺凝胶中，向亦极泳动速度快慢主要是按照分子颗粒从小到大小依次排开得以分离的技术方法。,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,设备简单、操作简便、快速、重复性好、样品无需纯化。由于同时存在三种效应，因此分辨率和检出灵敏度高。,技术主要特点：,技术主要应用范围：,除了分离分析蛋白质亚基种类、表达剂量之外，还可用于测定未知蛋白质亚基分子量。,（一）SDS-PAGE 分离基本原理,蛋白质分子的解聚,SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。,在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。因此，SDS-PAGE过程中蛋白质分子在凝胶中的泳动速度主要取决与亚基的分子量大小。与PAGE技术方法相似，蛋白质亚基在电泳过程中存在三效应。,蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变：,（二）未知蛋白质分子量的测定,以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；,相对迁移距离 (Relative migration,cm),logMr,Unknown protein,1.电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽,四、电泳常规设备,2.电源:,3.脱色、染色槽,4.凝胶成像分析系统,思考题：,1.常见的凝胶电泳有哪几种？说明其主要用途，并比较其主要优缺点。,2.简单说明PAGE技术方法对于样品中蛋白质的分离效果较好的主要因素有哪些，并简单解释相应因素产生的有原因。,3.从分离原理和实际应用两方面简单说明SDS-PAGE和PAGE技术方法有何主要区别？,4.影响蛋白质电泳分辨率的主要因素有哪些？,