一节免疫标记技术的基本概念

第一节第一节 免疫标记技术的基本概念免疫标记技术的基本概念一、免疫标记与标记免疫的概念二、常用的免疫标记物质 免疫标记与免疫标记与标记免疫标记免疫免疫标记技术免疫标记技术：标记物与免疫活性物质的联接技术标记免疫技术标记免疫技术：以标记免疫物质检测相应靶物质的技术常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 第二节第二节 酶标记技术酶标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与鉴定常用标记方法常用标记方法1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法戊二醛交联法戊二醛交联法(一步法）一步法）抗体-NH2 +COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶戊二醛交联法（二步法）戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗体-NH2 +CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度 第三节第三节 荧光标记技术荧光标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化常用标记方法常用标记方法1、荧光素的概念2、生物标记荧光素的要求3、常用荧光素标记原理与方法 生物标记荧光素的要求生物标记荧光素的要求1、具有与蛋白质共价结合的能力2、荧光效率高3、能与背景物质形成鲜明对比4、不影响蛋白质的生物、免疫活性5、标记方法安全、简便6、标记物稳定，易保存FITCFITC的标记原理与方法的标记原理与方法荧光素-N=C=S +NH2-抗体荧光素-N-C-N-抗体H S HRB200RB200的标记原理与方法的标记原理与方法荧光素-SO3Na +PCl5荧光素-SO2 Cl+PCl3 +NaCl荧光素-SO2 Cl +NH2-抗体 荧光素-SO2-NH-抗体+HCl 标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义 第四节第四节 放射性核素标记技术放射性核素标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化常用标记方法常用标记方法1、常用放射性核素2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法）间接法（连接法）直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T间接法（连接法）间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP间接法（连接法）间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白质H O H+NH2-蛋白质125I125I标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）应用意义本章小结本章小结1、免疫标记技术的概念2、常用免疫标记物质及其标记方法3、标记免疫物质的分离与鉴定思考题思考题1、何谓免疫标记技术？2、常用的免疫标记物质有哪些？3、酶标记的主要方法有哪些？4、F/P比值的实用意义如何？5、何谓比放射性？有何意义？第一节第一节 标记免疫技术的分类标记免疫技术的分类一、按指示标记物质划分的类型二、按测定方式划分的类型三、按测定用途划分的类型1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术5、金免疫技术按指示标记物质划分的类型按指示标记物质划分的类型1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按测定方式划分的类型按测定方式划分的类型均相型（均相型（homogenous）非均相型（非均相型（heterogeneous）双标记均相荧光免疫测定双标记均相荧光免疫测定酶扩大免疫测定技术酶扩大免疫测定技术1、免疫测定技术2、免疫组化技术按测定用途划分的类型按测定用途划分的类型 第二节第二节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验一、ELISA技术的原理与方法二、ELISA技术的操作注意要点ELISA技术的原理与方法技术的原理与方法间接法 夹心法 竞争法间接法间接法夹心法夹心法竞争法竞争法酶标仪酶标仪酶标仪酶标仪ELISA技术的操作注意要点技术的操作注意要点试剂器材操作环节 合适工作浓度 第三节第三节 荧光抗体技术荧光抗体技术一、荧光抗体技术的原理与方法二、荧光抗体技术的操作注意要点荧光抗体技术的原理与方法荧光抗体技术的原理与方法直接法间接法补体法双标记法 直接法间接法补体法双标记法荧光抗体技术的操作注意要点荧光抗体技术的操作注意要点标本处理染色操作 结果观测荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜使用原理荧光显微镜使用原理激发滤片（BG）吸收滤片（OG）标本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650激发滤片激发滤片吸收滤片吸收滤片荧光滤镜使用原理荧光滤镜使用原理 第四节第四节 放射免疫测定技术放射免疫测定技术一、放射免疫测定技术的原理与方法二、放射免疫测定技术的操作注意要点结合相游离相放射免疫分析法的原理与方法放射免疫分析法的原理与方法1 2 5 10 20 50 10040302010未标记抗原含量未标记抗原含量结结合、合、游游离离相相放放射射性性含含量量比比值值液闪仪液闪仪计数器计数器放射免疫测定技术的操作注意要点放射免疫测定技术的操作注意要点反应的温度与时间结合相与游离相的分离免疫标记技术的比较免疫标记技术的比较 FIA ELISA RIA敏感性 较低 高 高特异性 高 高 高重复性 差 好 好检测对象 Ag/Ab Ag/Ab Ag本章小结本章小结1、标记免疫技术的类型2、ELISA技术的原理与方法3、荧光抗体技术的原理与方法4、RIA技术的原理与方法思考题思考题1、如何区别均相型与非均相型的测定方式？2、ELISA分几种类型，各有哪些特点？3、适于标记的荧光素应符合哪些要求？