替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用研究及机理探讨

替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用研究及机理探讨 中南大学硕士学位论文替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用研究及机理探讨姓名:周于禄申请学位级别:硕士专业:药理学指导教师:刘世坤20060501硕士学位论文 中文摘要替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏的作用及机制探讨摘要目的:观察血管紧张素受体拮抗剂替米沙坦、传统补肾中药六味地黄丸以及两药联用对糖尿病肾病肾脏是否具有保护作用,并通过研究药物对实验性糖尿病肾病?大鼠肾脏核因子一 活化的影响,观察其活化、位移与肾脏功能、病理变化以及肾组织中、一、?表达之间的关系,初步探讨药物肾脏保护作用的机理。方法:试验大鼠随机分为组:正常对照组组,糖尿病。肾病组组,糖尿病肾病六味地黄丸组组,糖尿病肾病替米沙坦组组,糖尿病肾病替米沙坦与六味地黄丸联合治疗组组,糖尿病肾病胰岛素治疗组组。糖尿病肾病大鼠采用一次性腹腔注射链脲佐菌素/诱发为糖尿病,周后出现微量蛋白尿即成为糖尿病肾病模型。各组大鼠每周测血糖,每周断尾取血测血清肌酐、尿素氮、尿酸,收集小时尿液测定蛋白排泄量;并分别于成模后第、周末从各组实验动物中随机选取大鼠只,称量体重,收集小时尿液后处死,并留取血液、肾组织。用快速血糖仪测定血糖浓度,用全自动生化分析仪测定肾功能,应用放射免疫法测定小时尿蛋白排泄量,普通病理染色观察肾脏病理改变,分析药物对大鼠肾脏是否具有保护作用。在此根底上用免疫组织化学法观察肾小球中? 活化以及一、一、?表达量,分析?活化与、一、?表达量以及肾脏肥大指数、尿蛋白量、肾功能之间的相关关系,初步探讨药物保护作用的机理。结果:替米沙坦和六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏均有保护作用,两药合用时作用更为明显。具体表现为:血清尿素氮、肌酐、尿酸指标、小时尿蛋白以及肾脏指数均低于糖尿病肾病组;病理检查显示肾小球、肾小管以及肾血管病变明显减轻,炎症细胞浸润减少。同时发现:替米沙坦、六味地黄丸在一段时间内周内有降低血糖作用;胰岛素对糖尿病肾病大鼠除能降低血糖外,不能改善糖尿病.中文摘要硕二仁学位论文活化位移均肾病大鼠肾脏功能以及抑制肾脏肥大。替米沙坦和六昧地黄丸对?有抑制作用,并降低?、一、?表达量,统计分析显示肾小球细胞核内 阳性表达与一、一、?蛋白表达量及尿蛋白量和肾功能指标呈显著正相关。结论:.、替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用,两药合用有增,强对肾脏保护的作用。、替米沙坦与六味地黄丸在一定时间内能影响糖尿病肾病大鼠血糖浓度。、替米沙坦与六昧地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏这一保护作用与? 有密切关系。具体机理可能是通过抑制? 活化,从而抑制受? 调控的?、?等炎症因子和细胞因子的表达,最终抑制肌成纤维细胞转化和分泌,减少肾脏间质产生而抑制肾脏纤维化保护肾脏功能。、替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病肾脏的保护作用与降低血糖浓度的作用关系可能不大。关键词:替米沙坦,六味地黄丸,糖尿病肾病,. ,.,.硕士学位论文英文摘要 ?, , 一、一、?,.:? ,?. / , ,. ,.: ,英文摘要硕士学位论文, , ,. , ,., ,、.? ,、一、? ., ?、?、 ?:八匣., 一一、一、?,. , ,.,/. / ,. .: ., .,. . . ?. . ,一、., .:, ?,一,一,?.硕士学位论文替米沙坦与六昧地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用的实验研究前言糖尿病肾病,即糖尿病肾病性肾小球硬化症,这是一种以微血管病变为主的肾小球病变,是糖尿病常见的慢性并发症之一,在糖尿病人群中的发生率为%,伴有终末期糖尿病肾病的年生存率小于“,已成为终末期肾衰的主要病因,也是糖尿病致命的主要原因。.糖尿病肾病的病因和发病机制十分复杂,目前仍不是十分清楚,病因涉及代谢、细胞因子、生长因子、遗传等多种因素,近年来研究发现糖尿病肾病发生与肾脏局部组织中 的水平明显升高、 的活化密切相关“。血管紧张素,作为强缩血管物质,不仅参与了全身和肾脏局部血流动力学的调节,引起入球小动脉和出球小动脉阻力增高从而导致肾小球硬化“叮; 能增强肾小也是目前公认重要的促炎症因子和促细胞生长因子,球细胞中的结合活性彻,刺激肾小球膜细胞? 等炎症因子活化位移,活化可促使、基因表达增强,使单核/巨噬细胞浸润、肌成纤维细胞和肾小球内细胞增生,最终导致细胞外基质蛋白积聚以及肾问质的纤维化删.由于炎症细胞的浸润、肾小球系膜细胞增生以及肾小球纤维化等加速糖尿病肾脏的损伤。使糖尿病肾病最终开展为终末期肾病队姗.临床研究说明血管紧张素转换酶抑制剂 和 受体拮抗剂,治疗糖尿病肾病具有减少蛋白尿、预防肾小球硬化等作用“嘲.因此可以推测抑制剂替米沙坦同样具有保护糖尿病肾病肾脏的作用,且保护作用可能与抑制卜 的活化有关。祖国医学治疗糖尿病及其肾病有着丰富的经验,中医认为糖尿病肾病属于中医“消渴病范畴,本病多由。嗜食酒类肥甘之品,酿成燥热,致阴液耗损:情志刺激,气机郁结,久郁生热:生活失常,肾阴虚损,脏腑柔弱导致本病发生。如刘河间云:“此乃五志过极,皆从火化,热盛阴伤,致令消渴“町。其病机系“阴虚为本,燥热为硕学位论文标。因此本病多采用滋补肾阴的方法治疗。六味地黄丸由熟地黄,山茱萸,山药,泽泻,牡丹皮,茯苓等味中药组成,作为经典滋阴补肾药品而广泛使用至今。临床研究报道:六味地黄丸不仅可降低血糖,改善糖尿病患者代谢紊乱;与达美康、格列美脲等降糖药合用能明显增强降糖效果,保护靶器官,延缓和减少糖尿病并发症的发生“;降低红细胞醛糖复原酶活性和尿蛋白排泄率“。实验研究发现六味地黄丸不仅有降低糖尿病大鼠的空腹血糖、增加糖尿病小鼠肝糖元的含量,降低肾组织中过氧化脂质含量,提高超氧化物歧化酶活性外,还具有防治糖尿病血管并发症,抑制糖尿病大鼠肾脏纤维化的作用;与消渴丸合用具有协同作用,可降低实验动物血糖并调节脂代谢紊乱“。作为半衰期最长,最为持久、平稳抑制.受体的类药物替米沙坦,经典补肾中药六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏是否具有保护作用,以及中西药物联用是否具有协同作用及作用机理目前缺乏公开的研究报导。我们实验分为两局部,第一局部为药物对糖尿病肾病保护作用的研究,采用建立糖尿病肾病大鼠模型的方法,观察替米沙坦或和六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠体重、肾重、肾脏指数、肾功能、小时尿蛋白排泄量以及肾脏病理结构的影响,研究药物是否对大鼠肾脏具有保护作用。第二局部为药物肾脏保护作用的机理探讨,通过免疫组织化学实验方法分析经替米沙坦或和六味地黄丸治疗的糖尿病肾病大鼠肾脏? 活化的影响,并观察其活性改变与肾脏功能和肾脏组织结构改变以及肾组织中、?表达之间的相关关系,初步探讨药物对肾脏保护作用的机制。硕学位论文 中英文缩写一览表中英文缩写一览表血管紧张素 血管紧张素受体拮抗;血窘籽龋帮化翱制越四瑚即商、咄秘访】.细胞粘附分子.单核细胞趋化蛋白.? .平滑肌肌动蛋白鼍核因子.螂肾素.血管紧张素系统野例细胞外基质黟眩链脲佐菌素六味地黄丸干预组 替米沙坦干预组胰岛素干预组,正常对照组糖尿病肾病对照组糖尿病肾病声明硕士学位论文,原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的奉献均已在本论文中作了明确的说明。日作者签名: 日期:壶竺翌笸年 笪月 垂关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保存、使用学位论文的规定,即:学校有权保存学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或局部内容,可以采用复印、缩影或其他手段保存学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。?轹睁臌。峭硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究论文正文第一局部替米沙坦与六昧地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用研究糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症及主要死亡原因之一。糖尿病患者一旦尿蛋白排泄量增加,就几乎不可能阻止患者开展为肾病,但经过药物治疗完全有可能延缓病程的开展。全世界约有%糖尿病患者有微量蛋白尿,在亚洲糖尿病肾病的发病率尤其高。多数研究认为,阶段严格控制血糖的作用并不很明确,但使用抗高血压药物或类,通过抑制肾素一血管紧张素系统对的作用十清楚显。在祖国医学中糖尿病肾病被称为消渴病肾病,其病因为肾阴虚,“消渴日久,伤阴耗气,阴损及阳,“禀赋缺乏或劳伤太过,亦可开展为肾元亏虚是其根本开展趋势。作为半衰期最长的受体拮抗剂,具有长效,平稳抑制作用的替米沙坦,以及经典补肾中药六味地黄丸是否对糖尿病肾病具有保护作用目前国内尚未见研究资料,本课题通过建立大鼠模型,经替米沙坦、六味地黄丸以及两药合用对大鼠干预,观察药物是否具有保护肾脏功能的作用。仪器及材料.主要试剂和药品:替米沙坦 德国勃林格殷格翰制药公司六味地黄丸 湖南九芝堂制药链脲佐菌素 公司长效猪胰岛素 万邦制药血糖试纸 美国雅培公司尿蛋白试剂盒 北京北方生物技术研究所其余试剂 国产分析纯硕士学位论文第一局部肾脏保护作用研究.主要仪器设备全自动生化分析仪 日本日立公司快速血糖仪美国雅培公司分光光度计 上海第三分析仪器厂.型精密电子天平 湘仪天平仪器厂恒温水浴箱 上海博讯实业高性能超净工作台 上海瑞仰净化装备病理石蜡切片机。德国徕卡全自动组织脱水机, 德国徕卡低温离心机. 法国离心机诺和诺德胰岛素电子注射器 诺和诺德公司超低温冰箱: .超纯水仪试验方法.实验性糖尿病肾病动物模型制各健康雄性 大鼠,体重,由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。试验前进行尿常规、尿糖检查,剔除原发性尿蛋白阳性和尿糖阳性大鼠。参考徐淑云糖尿病肾病造模方法“,大鼠禁食后,一次性腹腔注射链脲佐菌素 ?茸,用. ?柠檬酸钠柠檬酸缓冲液新鲜配制;对照组的大鼠腹腔注射等容积的柠檬酸缓冲液。在注射后第天,用尿糖试纸测尿糖为阳性,快速血糖仪器检测血糖?那么糖尿病成立;此后每周收集一次大鼠小时尿液测定尿蛋白,假设出现微量蛋白尿即糖尿病肾病早期大鼠模型成立。实验期间大鼠自由饮水、进食。.实验动物分组试验动物随机分为组,正常对照组组,糖尿病肾病对照组组,糖尿病肾病替米沙坦治疗组组,糖尿病肾病六味地黄丸治疗组组,糖尿病肾病替米沙坦与六味地黄丸联合治疗组组,。糖硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究尿病肾病胰岛素治疗组组,。试验期间大鼠自由饮水、进食,除糖尿病肾病胰岛素治疗组使用胰岛素外,其各组均不使用胰岛素和其他抗糖尿病药物治疗。每周尾静脉取血,用快速血糖仪测空腹血糖一次;每周用代谢笼收集小时尿一次,用放射免疫法测定尿蛋白量;同时断尾取血,查血清肌酐、血清尿素氮、尿酸指标。组每日每公斤体重.替米沙坦混悬液定时灌胃一次;组每日每公斤体重.六味地黄丸浓缩丸混悬液定时灌胃次;组每日每天给予.替米沙坦和.六味地黄丸浓缩丸,用法与、组相同:组皮下注射长效猪胰岛素,将血糖降低至./左右,具体剂量因个体而异;组和组仅给予。等量自来水罐胃。分别于成模后的第、周末随机选取各实验组大鼠只,称量动物体重后腹腔注射%戊巴比妥钠.麻醉,收集小时尿液测定尿蛋白量后,处死并抽取血液、别离血清测定肾功能,迅速取出肾脏称重后反复用生理盐水,灌洗双肾,放入的中性福尔马林溶液中固定。.尿蛋白测定分别于造模后第、周末用代谢笼收集小时尿液,参加二甲苯防。腐,用放射免疫法测定尿蛋白.肾功能测定分别于成模后第、周末断尾取血.,别离血清,采用全自动生化分析仪测定血清肌酐、尿素氮以及尿酸浓度。.血糖测定每周三:开始禁食不限制饮水,次日:尾静脉取血,用美国雅培公司快速血糖仪测定。.蜡块制作固定后的肾脏分为.厘米厚的小段;依次放入%、%、%的乙醇中除去组织块中所含有的水分;将脱水组织浸入二甲苯溶液中分钟,到达透明;肾组织块浸入溶化的石蜡中 .小时,以致石蜡浸入肾组织;将溶化的石蜡倒入包埋框,立即将浸蜡后的组织块放入,待蜡块稍凝后,置冷水中加速凝固。硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究将蜡块组织修好,冷却备用。.常规腿染色石蜡切片二甲苯脱腊分钟; .无水酒精、%、%、%度酒精,入水各分钟;苏木素染色分钟,自来水冲洗;%盐酸酒精分化,自来水冲洗;%氨水返蓝,自来水冲洗;伊红染色;%,%、%、无水酒精梯度脱水各分钟;石蜡切片二甲苯脱腊 分钟;二甲苯透明分钟;中性树胶封片。.肾脏指数的计算周末处死动物前称量大鼠体重,处死后迅速取出大鼠肾脏并称量左侧肾重。求出肾脏指数单侧肾脏重量/鼠体重。.统计分析所有数据统计处理采用.软件包。数据均以均数标准差表示。实验组与对照组均数差异的比拟采用.检验,治疗组均数两两问比拟采用.检验,双侧.认为有统计学意义。结果.一般资料所有大鼠进入实验前尿常规蛋白定性均为阴性。注射 周后入选大鼠数目分别为:组只,组只,组只,组只,组只,组只,共只。实验前周时有只动物出现死亡,检测当时血糖及尿常规与非死亡动物无明显差异,考虑是由于尾静脉取血后感染致死,后每周常规腹腔注射青霉素一次万单位/公斤体重后再无动物死亡。只动物在实验过程中血糖转为阴性,因此剔除。整个实验过程并未出现糖尿病酮症酸中毒。硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究.尿蛋白排泄量组实验各阶段尿蛋白排泄量与同期组相比均有明显升高,周末已远远超过晚期糖尿病肾病的标准/,为组的.倍.;、和组低于同期的组,周末分别是组的.、.、.倍.;、和组间尿蛋白依次为组组组,、组间存在显著性差异.。胰岛素组与组均有大量蛋白尿排泄,组间无差异.。以上结果说明替米沙坦与六味地黄丸均可减少大鼠尿蛋白排泄,使大量蛋白尿出现的时间延缓。详,见图,附表葛苫【. . . .,“.;. .肾功能.血清尿素氮组与同期组比拟明显增高,周末是组.倍.;、及组各期较组轻,分别为组的.、.、.倍,、和组硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究依次为组组组,、与组存在显著性差异.,说明替米沙坦、六昧地黄丸尤其是两药合用后可明显降低大鼠血清尿素氮的水平。详见图、附表蕊衢,/目重惦;二鏖兰髟士一至:丰置扣一. . . . .;印.捌. . .血清肌酐实验大鼠各组血清肌酐值增幅波动较大,总的趋势为随着病程的开展肌酐值增加。组各期明显较组增高,周末是组.倍.;,、组各期低于组,在周内组间无差异.,周末分别为组的.、.、.倍.,、组间无显著性差异.但与组相比差异明显.,说明中西药物合用后有降低大鼠血清肌酐的作用。详见图,附表卜.血清尿酸大鼠随病程开展而增高,组各期较组明显增高,周末是组.倍.;、组各期较组轻,周末分别为组的.、.、.倍,、组与组有显著性差异.;与组间无显著性差异硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究.。以上结果说明替米沙坦干预后明显抑制大鼠增长,六味地黄丸作用,较弱。详见图,附表卜芒辅群 . . . ;.乍. . .,眚 ,. .仃. . .;卯.栅. .。. ? .硕士学位论文第一局部肾脏保护作用研究. .血糖组各阶段血糖均较组明显升高,分别是组的.、.、.、.倍尸礁们;实验前周和组血糖值低于组,在第周差异最为明显,分别是组的.、.、.倍.,周后、组血糖值与组之间差异减小.,组血糖仍略低于组;周时大鼠各组间血糖无差异。胰岛素组血糖各时间内控制良好,与糖尿病正常对照组无差异.。以上结果说明六味地黄丸、替米沙坦具有抑制早期大鼠血糖升高的作用,但周后之一作用逐渐消失,两药物合用后降低血糖作用时间延长。详见图,附表,、蕊笛. . .“.;.槲.?. .肾重、体重与肾脏指数各组大鼠左侧肾重帆、体重、肾脏指数魁统计结果见附表一。.周末组大鼠肾重、肾重/体重肾脏指数与组相比明显增加,而体重璁鲢葡连魄、轻,分别是组的.、.以及.倍.;、组肾脏重量明显轻于组.,体重略有增加,、和组肾脏指数低于组.;.硕士学位论文第一局部肾脏保护作用研究、组之间比拟,与组各值无明显差异,组肾脏指数明显低于、组.。以上结果结果说明替米沙坦与六味地黄丸对大鼠体重虽然没有统计学差异,但总体趋势是增加的,且明显抑制大鼠肾脏肥大.降低大鼠肾脏指数。结果详见图、附表 ,. . . . 押.?. .、.肾脏病理变化普通染色结果.正常对照组:染色下组不同时间点肾脏结构清楚,细胞核呈蓝色,胞浆粉红色.肾小球、肾小管结构完整、形态正常,未见肾小球结节样变等病理该病。.糖尿病肾病组大鼠:组大鼠糖尿病肾病初期,肾小球体积增大伴有大量炎症细胞浸润,肾小管那么表现为上皮细胞肥大、空泡样变性伴随着病程的进展;.周糖尿病肾病大鼠上述病变迸一步加剧,并出现毛细血管玻璃样病变、小管间质体积增大;第周末可见肾小球弥漫性和结节性肾小球硬化,毛细血管袢呈分叶状,基底膜及系膜基质增生,第一局部肾脏保护作用研究硕士学位论文系膜细胞明显增多;肾小管玻璃样变,小管基底膜增厚,肾小管逐渐萎缩,肾间质纤维化;肾动脉玻璃样变性。.药物干预组:、肾组织病理学在实验各阶段病变均轻于组。组大鼠肾病早期仍有肾小球体积增大、基底膜增厚、系膜基质增生等病变,未见肾小管上皮细胞肥大、空泡变性,仅见少量炎症细胞;周时肾小球系膜细胞增多,局部肾小球出现结节样变,肾血管玻璃样病变等病理改变。、组大鼠肾脏病理改变根本相同,肾病早期肾小球体积增大、基底膜增厚、系膜基质增生等病变明显减轻,炎症细胞浸润明显少于组;.周时才开始出现肾小管上皮细胞肥大、空泡样变性,肾血管未见异常;周末肾小球、肾小管明显好于组,仅少数肾脏出现肾小球弥漫性和结节性肾小球硬化,肾血管玻璃样变、肾基底膜增厚以及系膜基质增生等病变均较轻微。胰岛素干预组肾脏病理变化与糖尿病肾病组程度类似。详见彩图第一局部肾脏保护作用:究硕。学位论文彩图普通病理图片染色,:正常对照组;:糖尿病肾病组;.六味地黄丸组:替米沙坦组;.六味地黄丸与替米沙坦联合治疗组:胰岛素治疗组硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究讨论.糖尿病肾病成模状况诱导大鼠糖尿病动物模型的造模方法是糖尿病动物模型中较为成熟、稳定性好的方法之一【埔】。一般周后糖尿病大鼠出现尿蛋白排泄量比正常组高,其实质为早期肾脏损害,说明糖尿病肾病造模成功,实验大鼠进入糖尿病肾病早期阶段。.周蛋白尿排泄明显升高,糖尿病大鼠迸入糖尿病肾病中期。.周左右大鼠出现大量蛋白尿尿蛋白排泄量已远远超过./,实验动物进入肾病晚期【。附表.各组血糖水平和附表.各组尿蛋白水平的变化证实糖尿病肾病制模是成功的。.关于实验方法糖尿病肾病大鼠肾脏损害的标准尚无定论。实验发现:第周末,糖尿病组大鼠的小时尿蛋白量明显高于正常对照组及治疗组,已达早期糖尿病肾病的标准。另一方面光镜下观察糖尿病肾病的病理改变,周末出现早期肾脏肥大,肾小球系膜区有出现大量炎症细胞;.周肾血管壁增厚,进行性的系膜细胞增生,可见明显的肾小管上皮细胞的空泡样交性,小管简质体积增大;周可见毛细血管袢呈分叶状,肾小管逐渐萎缩,大量肾小球硬化性闭塞以及肾间质纤维化。.药物干预对糖尿病肾病的保护作用.替米沙坦对糖尿病肾病大鼠的保护作用有研究发现血管紧张素受体抑制剂能明显减少糖尿病并发症糖尿病肾病的发生以及终末期肾病的发生犁;氯沙坦、缬沙坦等治疗大鼠时与对照组相比拟。可明显减少大鼠血清尿素氮,肌酐、尿蛋白的排泄量,同时提高肾小球肌酐去除率,对肾脏有明显的保护作用【岔。在我们实验中发现,替米沙坦干预大鼠后大鼠体重增加,肾脏重量减轻,肾脏肥大指数减小;大鼠肾功能各项指标、小时尿蛋白排泄量都显著低于对照组,且大量蛋白尿出现的时间明显延迟,与文献报道的其他沙坦类药物作用相符。光镜下观察肾脏病理切片发现:替米沙坦组大鼠肾脏的病理改变明显轻于糖尿病肾病组, 周动物肾小球、肾小管形态明显好于组,肾小球弥漫性和结节性肾小球硬化减轻,系膜基质增生减少,肾间质纤维化、肾动脉玻璃样变性等病变轻于组。由此可以推断替米沙坦类似于缬沙坦、氯沙坦等其他类型的类药物,同样具有保护糖尿病肾硕士学位论文 第一局部肾脏保护作用研究病大鼠肾脏的作用。同时发现替米沙坦组干预糖尿病肾病后,血糖在前周低于糖尿病肾病组,尤其在第周左右最为明显.,周后与对照组无明显差异;替米沙坦作为一种临床常用类的降压药物近年来发现其还能激活,增加机体对胰岛素敏感性,抑制胰岛素抵抗作用【冰,替米沙坦激活受体的作用是缬沙坦的倍,实验中出现血糖降低是否与此作用有关有待进一步研究。.六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠的保护作用在临床研究中早已证明六味地黄丸具有减少肾病患者尿蛋白排泄量,保护肾脏功能的作用【。实验研究中发现六味地黄丸中的山茱萸、山药、茯苓均可降低血糖水平【】,熟地可提高大鼠血中胰岛素和肽的水平,对胰岛素细胞具有直接的作用效果,并对四氧嘧啶和肾上腺素所致大鼠高血糖有显著降低作用【卅;山药粗提物对大鼠和兔有降血糖作用,能控制四氧嘧啶引起的高血糖【矧,家兔皮下注射泽泻浸膏亦有轻度降糖作用,六味地黄丸还具有抑制肾纤维化的作用四。我们通过实验证实六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠的肾脏具有一定的保护作用,具体表现为:与大鼠对照组相比拟,大鼠肾重减轻,肾脏指数减小,减少了小时尿蛋白排泄量,降低血清尿素氮、肌酐、尿酸水平,并明显抑制了糖尿病大鼠肾小球增大、肾小管玻璃样变以及肾小球结节样变,减少炎症细胞的浸润:同时发现六味地黄丸对诱导的大鼠肾病早期有较明显降低血糖作用,第周血糖值仅为组大鼠的/,降糖作用比替米沙坦更为显著,但随着病程的开展而降低,周后大鼠血糖与组无差异,具体原因不明有待进一步研究。.替米沙坦与六味地黄丸中西药合用对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用在对糖尿病肾病的临床研究和实验室研究中至今未见使用类药物与六味地黄丸联合治疗的报道。本实验发现,联合干预后大鼠体重增加,并降低早期大鼠升高的血糖,降低幅度较单独使用两药物作用强。中西药物合用后更大幅度地的降低大鼠血清尿素氮、肌酐、尿酸水平,在周末仅为组/;对大鼠小时尿蛋白排泄量的作用最为突出,药物联合干预的大鼠尿蛋白水平在所有药物干预的大鼠中始终处于最低水平,在实验周后才有显著性升高,大量蛋白尿的出现时间远远落后于其他组,周时尿蛋白仅为组的/;同时也抑制了肾脏的肥大,周末肾脏指数约为组的/。光镜下普通病理切片发现,在硕士学位论文第一局部肾脏保护作用研究肾病初期,药物联合干预后肾小球体积增大、系膜基质轻度增生等病变减轻,肾小管上皮细胞肥大、空泡样变性开展缓慢;.周肾小球基底膜增厚、小管间质体积增大、肾血管玻璃样变以及肾小管萎缩等病变减轻;周末与相比肾小球弥漫性和结节性硬化以及肾血管玻璃样变明显减少。以上结果均说明中西药物联合干预对大鼠的干预后具有显著的肾脏保护作用,且比药物单独使用强,协同作用明显。但同时发现,中西药物合用在周时动物各项指标均有向糖尿病肾病组靠近的趋势,也提示联合干预并不能完全阻断肾脏病理改变和肾功能的衰退。.胰岛素对糖尿病肾病大鼠肾脏的作用实验发现,使用胰岛素治疗大鼠,可有效控制大鼠血糖,增加方鼠体重,但并不能降低大鼠蛋白尿排泄量以及延缓肾功能衰退的进展,尤其在实验周后肾功能各项指标、小时尿蛋白排泄量以及肾脏重量与组大鼠无显著性差异,提示高血糖并不是开展的唯一原因,控制血糖并不能阻断的病程发展,这与国内外众多实验结果相符合。结论、替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用,两药合用有增强肾脏保护的作用。、替米沙坦与六味地黄丸在一定时间内均能影响糖尿病肾病大鼠血糖浓度。、胰岛素对大鼠肾脏保护作用不明显。硕士学位论文 第二局部肾脏保护作用的机理研究第二局部替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用的机理研究,糖尿病肾病的病因和发病机制十分复杂,目前仍不是十分清楚,病因涉及代谢、细胞因子、生长因子、遗传等多种因素,近年来研究发现糖尿病肾病发生与体循环、肾脏局部组织中 的水平明显升高以及的活化密切相关“。第一局部实验结果证实替米沙坦,六味地黄丸对糖尿病肾病具有保护作用,药物干预后肾功能好于对照组,肾组织中炎性细胞浸润减少,肾脏纤维化减轻。这一保护作用是否与抑制炎性起始因子卜 的活化及其下游因子、表达有关,我们进行了初步探讨。仪器及材料.主要试剂和药品:一平滑肌肌动蛋白?武汉博士德生物技术细胞间粘附分子?试剂盒 晶美生物技术单核巨噬细胞趋化蛋白一试剂盒 北京中山生物技术试剂盒北京中山生物技术其余试剂 国产分析纯.主要仪器设备倒置相差显微镜型 日本三目显微镜, 日本奥林巴斯病理图像分析系统北航图像技术上海瑞仰净化装备培养箱.型精密电子天平 湘仪天平仪器厂恒温水浴箱上海博讯实业压力蒸气灭菌器 上海博讯实业低温离心机玎.冰箱日本索尼病理石蜡切片机, 德国徕卡全自动组织脱水机, 德国徕卡硕士学位论文 第二局部肾脏保护作用的机理研究试验方法.标本处理及蜡块制作.标本处理分别于成模后的第、周末随机选取各实验组大鼠只,腹腔注射%戊巴比妥钠.麻醉后处死,迅速取出肾脏称重后反复用生理盐水灌洗双肾,纵向剪开肾脏,放入%的中性福尔马林溶液固定。.蜡块制作固定后的肾脏分为.厘米厚的小段;依次放入%、%、%的乙醇中除去组织块中所含有的水分;将脱水组织浸入二甲苯溶液中分钟,到达透明;肾组织块浸入溶化的石蜡中 .小时,以致石蜡浸入肾组织;将溶化的石蜡倒入包埋框,立即将浸蜡后的组织块放入,待蜡块稍凝后,置冷水中加速凝固。将蜡块组织修好,冷却备用。.免疫组织化学染色先将载玻片过胶、编号;石蜡标本切片,厚度为;烤片过夜;常规脱蜡至水;用新鲜配置的%浸泡一分钟以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗次,每次间隔分钟; 、按照推荐条件进行微波修复;参加正常山羊血清封闭液,室温分钟后,滴加相应一抗,选糖尿病对照组原表达最丰富用代替相应一抗作为阴性对照,过夜。一抗的稀释度为:;滴加生物素化羊抗兔二抗分钟,冲洗分钟次;滴加三抗,分钟;冲洗分钟次后,使用显色试剂盒室温下显色,光镜下控制反响时间;蒸馏水冲洗次,每次分钟后苏木素复染;脱水透明后用中性树胶封片。硕士学位论文 第二局部肾脏保护作用的机理研究.原始数据采集及切片图像处理.免疫组化染色阳性结果判断正常情况下在肾小球系膜细胞与肾小管小管上皮细胞上的胞浆内呈棕黄色表达,细胞核较少表达。阳性结果为肾小球系膜细胞和小管上皮细胞的 在细胞核内活化,细胞核内出现棕黄色染色 表达或表达增多。、?正常情况下细胞浆中表达较弱,细胞浆呈淡蓝色,阳性表达时表达部位组织呈棕黄色或金黄色,一般分布于肾小球系膜细胞的胞浆、或肾小管上皮细胞的胞浆等部位。.阳性指数的计算采用北航图像采集模块软件,每组切片随机采集个肾小球视野倍放大,用免疫组化分析模块软件对每个视野的肾小球进行阳性目标分割、视野编辑去除非组织视野所占空间等后,得出每个肾小球视野阳性目标面积 以及阳性单位 ,阳性单位即阳性部位的平均吸光度或灰度,阳性越强其数值越大:求出阳性指数 ,阳性指数阳性面积阳性灰度。阳性指数反响免疫组化阳性目标的总强度,即抗原总量。为保证测定数据的准确性,对每个统计场的参数进行三次操作,取三次结果的平均值作为统计场参数进入统计分析的原始数据。.统计分析所有数据均用.软件包处理,以均数标准差夏表示。实验组与对照组均数差异的比拟采用检验,治疗组均数两两间比拟采用检验。相关分析采用相关分析。双侧.认为有统计学意硕士学位论文 第二局部肾脏保护作用的机理研究结果.肾脏免疫组化.组肾组织中 主要在肾小球膜细胞的胞浆中表达且数量较少,细胞核极少见阳性表达。组 在周为阳性表达顶峰,周表达最强烈,是同期组的.倍.,随后随着病程延长而减弱。、组肾小球内蛋白表达在实验各阶段始终较组弱,表达由强到弱依次为组;、组在.周时为表达顶峰,但仍低于组;组阳性表达顶峰出现在周,且阳性指数为同期糖尿病大鼠组中最低值。.周内与以及与治疗组组间均存在显著性差异.;组与组在第周后无显著性差异;周末、及组阳性表达无差异.。可见替米沙坦和六味地黄丸对大鼠肾脏均有不同程度的抑制作用,使阳性表达峰值下降并使顶峰延迟。详见图,彩图,附表.囵团口口田口 . . .;船.槲.。. .硕士学位论文 第二局部肾脏保护作用的机理研究. ;正常对照组;:糖尿病肾病组;:六味地黄组;:替米沙坦组;:六昧地黄丸与替米沙坦联合治疗组:胰岛素治疗组以细胞核棕染为阳性结果彩图:硕士学位论文第二局部肾脏保护作用的机理研究. .组肾组织内.根本不表达或弱表达;、及组周开始在肾小球内沿毛细血管壁及系膜区呈现线状表达较多,并随时间表达逐渐增强,周末表达最为强烈。周末组阳性指数为组的.倍.;、和组表达较明显弱于组,分别是组的.、.、.倍.。组的表达与其他实验组同期相比均为最少尸.。实验周后组与组间无差异.。可见、对大鼠表达有抑制作用,中西药物联用作用最为明显。详见图,彩图.,附表。 . . . . . ;卯.辨. .甾“。【.争硕七学位论文 第二局部肾脏保护作用的机理研究彩图? :正常对照组:糖尿病肾病组;:六味地黄组;:替米沙坦组;:六味地黄丸与替米沙坦联合治疗组:胰岛素治疗组以细胞浆棕染为阳性结果.彩图?硕士学位论文第二局部肾脏保护作用的机理研究. .组肾组织中.有比拟弱的表达,、及组周开始.在肾小球内沿毛细血管壁及系膜区呈现线状表达较多,并随时间表达增强,周末表达最为强烈,周时组肾小球内.阳性指数是组.倍.:及组肾小球内.蛋白表达少于组,分别是组的.、.、.倍.;在?周与组、与组间存在显著性差异.。组与组在实验周后表达无差异.由此说明、可不同程度的抑制表达详见图,附表.,附图.留邕?. .、,. ,. .;卯. 槲.。. .、第二局部肾脏保护作用的机理研究硕十学位论文?:以细胞浆棕染为阳性结果;正常对照组;:糖尿病肾病组;:六味地黄组:替米沙坦组;:六味地黄丸与替米沙坦联合治疗组:胰岛素治疗组以细胞浆棕染为阳性结果硕士学位论文第二局部肾脏保护作用的机理研究. 组肾组织内.根本不表达,糖尿病大鼠那么在第周肾小球系膜细胞胞浆中表达已经明显增加。组周时.即呈强阳性,周阳性指数到达最高值为组的.,随后逐渐减低。、 组在加周前处于增长趋势,周到达最高值,分别是同期组的.、.、.倍,随后逐渐减弱;组阳性指数低于、组,且与组间存在差异.。周末各实验组蛋白表达量无显著性差异.;组与组两组间实验各阶段未见显著性差异尸.。、组阳性表达少于组,说明药物干预后肌成纤维细胞转化减少,将导致系膜间质增生、肾小球硬化等病变减弱。详见图,附表,附图昔.:旨。,单.。. .;乍.捌. . .硕十学位论文 第二局部肾脏保护作用的机理研究.正常组.主要存在于肾间质血管和入球小动脉的血管壁,肾小球、肾小管问质细胞偶有表达,糖尿病.除血管壁外,肾小球系膜区、肾质表达明显增强,肾小管上皮偶有表达:正常对照组;:糖尿病肾病组;:六味地黄组:替米沙坦组;:六味地黄丸与替米沙坦联合治疗组:胰岛素治疗组以细胞浆棕染为阳性结果彩图?顽学位论文第二局部肾脏保护忭用的机珲研究.肾小球中 与尿蛋白量、肾功能以及、一、蛋白表达的相关关系糖尿病肾病大鼠、周末.在肾小球中呈强阳性表达,与实验终点对应组尿蛋白量、血清肌酐、尿素氮、尿酸以及肾脏指数呈正相关,值分别为.、.、.、.、.、.、.、.、.、.均具有统计学意义.,具体见附表一。实验过程中 与、?姒的阳性指数成正相关关系,值分别为.、.、.:、周.与周一、?的阳性指数线性关系更为明显.,值分别为.、.、.、.、.、.。具体相关关系,详见附表.。讨论.关于免疫组化结果分析免疫组化阳性结果的判断是免疫组化技术的难题之一.传统方法是半定量统计方法。本研究采用北航图像处理系统,从图片的视野随即采集到最后测量及计算,全部程序化工作,大大减少了主观失误的概率。阳性面积描述了阳性目标着色范围,阳性灰度那么描述了阳性目标的着色强度,两者乘积综合了面积以强度的综合效应。较以往的半定量结果更加客观可靠。每个统计场参数均取三次的均值作为原始数据,强化了结果的稳定性和客观性。.保护作用机理核因子 ,一 广泛存在于真核细胞内,是将信息从细胞浆传至胞核引起相应基因表达重要的炎症起始因子,调控着一系列趋化因子和粘附分子的表达。趋化因子与粘附分子在肾脏组织中炎症细胞浸润以及介导肾小球纤维化过程中起着重要作用,活化的 通过调控这些因子的转录过程,在的发生和开展中处于核心地位啪。本实验发现大鼠在发病早期阳性表达即明显增高,阳性表达顶峰明显早于、一、,且与上述因子有明显相关关系,说明在诱导的大鼠中起着始动作用。其他相关性研究发现抑制肾脏 活性可减少炎症细胞浸润以及抑制多种致炎因子基因的过度表达;在大鼠模型中,使用 抑制剂可以抑制问质性肾炎炎第二局部肾脏保护作用的机理研究硕士学位论文症和终末期肾病的发生“。在实验中我们发现经替米沙坦、六味地黄丸药物干预后大鼠后? 阳性表达顶峰延迟,峰值减小,随后大鼠尿蛋白排泄量、肾功能指标以及肾脏病理改病等相应地减弱,尤其是两药物联合使用后抑制更为明显,提示替米沙坦和六味地黄丸对的保护作用与抑制 活化,位移是有关的。有研究发现在肾小球膜细胞和肾小管上皮细胞上?活性由受体调节?,在诱导卜 活化位移中起着重要作用。多个动物模型的研究中发现,活化,并通过 、促分裂原活化蛋白激酶与受体结合,促使等级联放达、蛋白和氧化复原途径等数个细胞内信号系统作用,促进血管细胞粘附分子一一、细胞粘附分子、白细胞介素一一和单核细胞诱导蛋白一一等促炎因子释放增加州。在肾脏组织中细胞问粘附分子 ,一通常以低水平表达起着调节细胞与细胞间、细胞与细胞外基质问相互结合、粘附作用啪。单核细胞趋化蛋白一能由单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维母细胞,肾组织细胞等多种细胞产生,主要功能是与其受体特异性结合发挥趋化和冲动单核细胞致炎症部位的作用。由于、其基因启动子部位均存在 的结合位点,因此一、的表达受到 活化的调节。时由于肾小球高滤过的诱导并使 活化,、一基因表达增强,促使单核/巨以及噬细胞浸润。单核/巨噬细胞大量浸润肾脏间质,与肾细胞相互作用,产生多种炎症/硬化介质,如细胞因子、血管活性因子、生长因子、趋化因子和粘附分子等。一方面,这些炎症/硬化介质可以刺激肌纤维细胞产生细胞外基质,在肾间质的过度沉积,促使肾小管萎缩、间质纤维化和小管周围毛细血管丧失;另一方面,炎症/硬化介质导致宿主细胞系膜细胞、上皮细胞、小管间质细胞、血管及血管周围细胞的表型变化,转变为肌成纤维细胞呻州。肌成纤维细胞兼具有平滑肌细胞和成纤维细胞的特性,既具有能够引起收缩的微丝样结构,又能产生胶原和细胞外基质成分,引起肾间质纤维化的发生和肾脏结节样病变?】。在实验中我们观察到大鼠肌成纤维化细胞的标志蛋白表达明显增高,与活化呈显著相关。实验中组大鼠经替米沙坦或和厂六味地黄丸干预后?阳性表达延迟、顶峰降低,随后大鼠肾脏肿、表达相应减弱,可以推测 对大鼠肾脏保护作用是与药物抑制 活化,进而硕十学位论文第二局部肾脏保护作用的机理研究抑制、一、表达是有关系的。替米沙坦作为半衰期最长的类药物,众多研究发现其保护肾脏的机理是多方面的,除了本实验证实其通过抑制 的活化保护肾脏外,替米沙坦作为受体拮抗剂,还可以通过抑制 引起的肾脏血流动力学改变,减少肾小球血管病变等而发挥肾脏保护作用。肾脏组织中 分泌增加,导致入球小动脉和出球小动脉阻力增高处于超滤过,肾小球毛细血管压力增高,进而导致肾脏肥大、肾小球纤维化,肾功能下降以及蛋白尿出现,最终开展为肾功能衰竭捌。替米沙坦通过上述多重作用机制保护肾脏。实验发现六味地黄丸对肾脏的保护作用同样与抑制的活化位移有关,但其抑制卜 的活化位移的具体机制目前仍然不十清楚了,以及肾脏保护作用是否还有其他机理等有待进一步研究。综上所述,糖尿病肾病卜 活化位移是导致其肾脏损害的重要因素之一,抑制?活化是治疗中十分必要的环节。实验发现替米沙坦、六味地黄丸通过抑制大鼠肾脏卜 活化位移,降低和延缓肾脏炎症因子、的表达,减少肌成纤维细胞的转化而起着保护肾脏的作用。两药联合应用可加强对大鼠肾脏的卜活化位移的抑制,对肾脏保护作用具有协同作用。结论、替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病大鼠肾脏这一保护作用与 有密切关系。具体机理可能是通过抑制 活化,从而抑制受 调控的、一等炎症因子和细胞因子的表达,减少单核巨噬细胞的浸润,最终抑制肌成纤维细胞转化和分泌,减少肾脏间质产生而抑制肾脏纤维化保护肾脏功能。、替米沙坦与六味地黄丸对糖尿病肾病肾脏的保护作用与降低血糖浓度的作用关系可能不大。硕学位论丈 参考丈献参考文献,&, 。甜正 . . .螂 ;:.、 ., , , :. .;:?.、 . ., ,;:.、 . & .;:. 、 , . ;:.、, , , . .; :.、. 地, ,. . ;:?.、,吼. ;:?.、 . , .: . ;:?.、. ;:, ,毗.、 . . ;:?.、 . ,. : .