微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析

HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 1HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 马放马放哈尔滨工业大学环境科学与工程系哈尔滨工业大学环境科学与工程系城市水资源与水环境国家重点实验室城市水资源与水环境国家重点实验室State Key Laboratory of Urban Water Resource and EnvironmentDept.of Environmental Science and Engineering,HIT微生物非培养技术的未知种群微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析检测与功能解析2HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 主要内容主要内容o 传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战 o 现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述 o rDNA序列同源性微生物鉴定及其种群组成分析序列同源性微生物鉴定及其种群组成分析中的应用中的应用o PCR扩增技术的应用扩增技术的应用 o 核酸探针杂交技术的应用核酸探针杂交技术的应用o DNA指纹图谱技术指纹图谱技术 3HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战 利用传统的微生物纯培养技术获得单一的微生物包括纯利用传统的微生物纯培养技术获得单一的微生物包括纯种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。4HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY o 微生物与农业微生物与农业o 微生物与工业微生物与工业o 微生物与医学微生物与医学o 微生物与环境保护微生物与环境保护o 微生物与能源开发微生物与能源开发传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战传统微生物培养技术的现状传统微生物培养技术的现状 微生物与人类社会微生物与人类社会5HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 在分子生物学诞生的20多年时间里，人们运用基因工程的几大基本技术：凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌转化技术、DNA序列分析技术及基因定点突变技术，对食品、医学、农业及环境保护等各个领域的应用微生物进行基因改造，实现了人为改造或修饰生物遗传特性并创造生物新性状的梦想。传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战传统微生物培养技术的现状传统微生物培养技术的现状 微生物与现代分子生物学微生物与现代分子生物学6HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 基因改造后的工程菌基因改造后的工程菌野生菌株野生菌株基因改造技术基因改造技术工程菌性能工程菌性能Yarrowia lipolytica DC-3-2N+离子束注入诱变育种对油脂的降解率提高了11.09%Sphingomonas sp.BHC-A转座子介导同源重组获得了降解有机磷农药的功能Candida tropicalis 和Candida lipolytica电融合融合菌的耐pH及耐高浓度铬的能力均优于亲本菌工业用酿酒酵母HDY-01基因敲除乙醇产量降低，适于生产低醇啤酒Chaetomium cupreum多点突变提高几丁质酶的表达量Bacillus thuringiensis定点突变提高对农业害虫甜菜夜蛾的毒力传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战7HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战 随着现代分子生物学的发展，尤其是可以利用16S rRNA技术鉴定纯培养物种的归属，大大丰富了我们所获得的环境微生物种类及遗传多样性。从分子水平上对微生物进行基因研究，为探索微生物个体以及群体间作用的奥秘提供了新的线索和思路。8HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，从而能够不受干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类对微从而能够不受干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，随着研究的生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，随着研究的不断进行，这一技术暴露出巨大的局限性不断进行，这一技术暴露出巨大的局限性平板计数异常平板计数异常(Plate Countanomaly)，即环境中微生物实际数量同平板菌落，即环境中微生物实际数量同平板菌落计数之间存在巨大差异。计数之间存在巨大差异。传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战9HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 造成平板计数异常的原因：1.由于实验室难以再现微生物的自然生存条件2.大种群微生物易形成优势种进而抑制了小种群的生长 传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战 因此，利用传统的纯培养技术总是重复筛选到相同的微生物，而多数难以被常规实验室方法培养的微生物被称为未培养微生物或不可培养微生物(Uncultured Microorganism)。10HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 微生物的自然多样性微生物的自然多样性结构多样性结构多样性代谢多样性代谢多样性行为多样性行为多样性进化多样性进化多样性生态多样性生态多样性传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战土土 壤壤海海 洋洋肠肠 道道11HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 传统环境微生物分析方法面临的挑战传统环境微生物分析方法面临的挑战 科学家根据现有的科学证据推测微生物种类数目应该在105-106。采用传统微生物培养技术对不同生境微生物可培养性的验证来看，海水中可培养的微生物约占0.001%-0.1%，淡水约占0.25%，土壤约占0.3%，活性污泥约占1%-15%左右。许多实验室证实，有些微生物处于一种活的但不可培养(Viable but Nonculturable，VBNC)的状态。据报道，至少有16个属的30种细菌属于此类微生物。因此，纯培养技术的局限性已经成为研究微生物自然生态和多样性的主要瓶颈，这迫使我们不得不重新审视传统的纯培养技术。12HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY The omics 组学技术组学技术GenomeTranscriptomeProteomeMetabolome现代分子生物学技术现代分子生物学技术现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述系系统统生生物物学学13HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述组组学学技技术术在在微微生生物物群群落落结结构构解解析析方方面面的的应应用用14HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述微生物非培养技术的产生与发展微生物非培养技术的产生与发展 微生物学家运用非培养方法来研究自然界中的微生物，即避开传统的微生物分离培养方法，利用DNA含有不同的信息内容和信息容量这一特性，直接研究细胞的DNA以获取自然界微生物的多样性及群落组成的信息，及从分子生态学的角度研究未培养微生物在环境中的变化。非培养技术的主要任务在于：革命性地改变了人们对原核生物多样性和自然界微生物群落组成的理解，并提供开发不可培养微生物资源的新途径。15HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 微生物多样性微生物多样性群落分析群落分析生物材料获取生物材料获取 DNA-DNA 复性复性 G+C 含量分析含量分析 DNA指纹分析指纹分析 直接直接PCR扩增扩增 宏基因组技术宏基因组技术现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述非非培培养养技技术术的的分分类类16HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述 以群落分析为目的的非培养技术 大尺度的分析群落大尺度的分析群落DNA的非培养法有的非培养法有DNA-DNA复性和复性和G+C含量分析两种含量分析两种方法，它们能分别方法，它们能分别给出所研究微生物给出所研究微生物群落总的基因多样群落总的基因多样性和结构的改变。性和结构的改变。DNA指纹技术指纹技术 大尺度群落分析大尺度群落分析变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(DGGE)扩增扩增rDNA限制性分析限制性分析(ARDRA)末端限制性片段长度多态性末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)核糖体基因间序列分析核糖体基因间序列分析(RISA)17HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述以生物材料获取为目的的非培养技术 1.基于目标瞄定的PCR直接扩增法，即不需知道基因的序列，仅根据 保守序列设计引物，就可以直接从环境DNA中扩增到目的基因，该 法方便、简单、快速但不易获得新型基因。2.宏基因组技术，即通过对环境DNA构建插入基因组文库，并利用活 性或序列筛选的方法以获取目标基因的新技术。宏基因组技术不仅可以将系统发育信息和未培养群落成员隐含的功能信息以及未被发现的有意义的新的功能基因联系起来，而且还可用于共生关系或其他简单群落中未培养群落的全基因组测序，有利于我们重新认识有意义但未被开发的生物学过程。18HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述微生物非培养技术的优势与局限性微生物非培养技术的优势与局限性 微生物非培养技术的优越性(1)发现新种发现新种(2)评价具有重要生态地位的种类评价具有重要生态地位的种类(3)古菌的研究古菌的研究(4)菌种与环境功能的关联菌种与环境功能的关联 非培养技术也有其缺陷和偏差。比如，克隆文库测序不完全，细胞非培养技术也有其缺陷和偏差。比如，克隆文库测序不完全，细胞裂解程度的不同、特定细胞裂解程度的不同、特定细胞DNA被优先扩增以及由被优先扩增以及由PCR的循环步骤带来的循环步骤带来的一些分析难题影响着克隆文库的应用。的一些分析难题影响着克隆文库的应用。19HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 现代环境微生物分析方法发展概述现代环境微生物分析方法发展概述微生物非培养技术的应用前景微生物非培养技术的应用前景(1)微生物多样性程度的测定微生物多样性程度的测定(2)生态学和进化生态学和进化(3)目标基因的获取目标基因的获取(4)非培养微生物特征的鉴定非培养微生物特征的鉴定(5)系统水平理解微生物群落动力学系统水平理解微生物群落动力学20HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析序列的微生物鉴定及种群组成分析 研究研究DNA多态性的最直接、有效的途径就是测定多态性的最直接、有效的途径就是测定DNA的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的DNA指纹技术中，指纹技术中，最常见的靶基因是最常见的靶基因是16S rDNA和核糖体和核糖体DNA的基因间隔区的基因间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)。细菌的细菌的rRNA 组成组成 21HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 细菌的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分别含有约为2900个、1540个和120个呈现不同碱基对排列的核苷酸。rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析序列的微生物鉴定及种群组成分析Carl Woese上世纪上世纪60年代末，年代末，Woese开始采开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的类，他通过比较各类生物细胞的rDNA特征序列，认为特征序列，认为16S rDNA及其类似的及其类似的rDNA基因序列作为基因序列作为生物系统发育指标最为合适。生物系统发育指标最为合适。22HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析序列的微生物鉴定及种群组成分析rDNA序列的微生物鉴定主要依据为：序列的微生物鉴定主要依据为：rDNA是生物体细胞中必要的成分，具有功能同源性且最为古老，而且同时含有保守序列和可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应等。23HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 用于一些DNA指纹分析方法（如DGGE/TGGE）的引物主要是针对16S rDNA为靶基因的引物，通过它的分析可以直接鉴定到属或种。根据核糖体16S rDNA结构变化规律，在所测定的区域中包括了V1、V2、V3、V8共8个高变区，尤其是V3这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。常用引物包括341F/534R（V3区）、968F/1401R（V6-V8区）、63F/534R（V1-V3区）、341F/926R（V3-V5区）等。rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析序列的微生物鉴定及种群组成分析16S rDNA24HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 常用常用16S rDNA序列引物序列引物引引 物物序列（序列（53）应用范围应用范围27fAGAGTTTGATCNTGGCTCAGPCR测序、多数真细菌109r1ACGYGTTACKCACCCGT广泛特异性109r2AKRCATTACTCACCCGT多数-紫细菌和一些-紫细菌342rCTGCTGCSYCCCGTAG多数真细菌357rCTCCTACGGGAGGCAGCAG多数真细菌519rGWATTACCGCGGCKGCTG多数真细菌、真核生物、古菌530rGTGCCAGCMGCCGCGG多数真细菌、真核生物、古菌685r1TCTACGRATTTCACCYCTAC-紫细菌、-紫细菌、梭菌属685r2TCTACGCATTTCACYGCTAC-紫细菌、-紫细菌685r3TCTRCGCATTYCACCGCTAC多数G+、蓝细菌、混杂细菌907rCCGTCAATTCMTTTRAGTTT多数真细菌、真核生物、古菌926fAAACTYAAAKGAATTGACGG多数真细菌、真核生物、古菌1100rGGGTTGCGCTCGTTG多数真细菌1114fGCAACGAGCGCAACCC多数真细菌1392rACGGGCGGTGTGTRC多数真细菌、真核生物、古菌1406fTGYACACACCTCCCGT多数真细菌、真核生物、古菌1492rTACGGYTACCTTGTTACGACTT测序多数真细菌、古菌1525rAAGGAGGTGWTCCARCC测序多数真细菌、古菌注：注：M=C或或A，Y=C、A或或T，K=G或或T，R=A或或G，S=G或或C，W=A或或T。25HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 1980年，Brosius等利用23S rRNA基因序列测定的方法推导出大肠杆菌23S rRNA的全部核苷酸排列顺序，整个分子含有2904个核苷酸。1981年相继有三个实验室提出了大肠杆菌23S rRNA的二级结构模型。目前已经获得了大量有关23S rRNA基因序列的信息，不同来源的23S rRNA约有60%70%的结构共同性。大肠杆菌23S rRNA的一级结构与酵母也有很大相似性。虽然已有大量的大肠杆菌23S rRNA基因序列信息，但是相比于16S rRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中还没有得到广泛的应用。rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析序列的微生物鉴定及种群组成分析23S rDNA 26HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析序列的微生物鉴定及种群组成分析核糖体核糖体DNA的基因间隔区的基因间隔区(ITS区区)细菌的细菌的rDNA通常由通常由5S、16S和和23S及一些间隔序列组成。及一些间隔序列组成。近十几年来，人们成功的以核糖体大小亚基基因间的间隔近十几年来，人们成功的以核糖体大小亚基基因间的间隔序列为对象，对细菌进行更细致的分类和鉴定，并对细菌序列为对象，对细菌进行更细致的分类和鉴定，并对细菌群落的结构和多样性进行分析。群落的结构和多样性进行分析。核糖体核糖体DNA的基因间隔区示意图的基因间隔区示意图27HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY PCR扩增技术的应用扩增技术的应用 PCR扩增原理示意图（左）及扩增原理示意图（左）及PCR仪工作原理曲线（右）仪工作原理曲线（右）DNA指纹技术通常需要大量的指纹技术通常需要大量的DNA片段，因此，需要一种手段能片段，因此，需要一种手段能够同比例的放大混合够同比例的放大混合DNA样品的量。聚合酶链式反应（样品的量。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）通过试管中进行的）通过试管中进行的DNA复制反应使极少量的基复制反应使极少量的基因组因组DNA或或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增几百万倍。样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增几百万倍。28HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 不同种类的PCR方法方法名称方法名称基本原理基本原理适用范围适用范围特特 点点巢式PCR利用两套PCR引物（巢式引物）对DNA模板进行两轮PCR扩增反应。一般应用于动物方面，如：病毒、梅毒螺旋体、HIV、肿瘤基因的检测等。降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性及检测的可靠性。反向PCR用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段。仅知部分序列的全长cDNA的克隆，曾被用于扩增基因文库的插入DNA。简单快速，可以研究许多独立克隆。对条件要求较高，需优化。原位PCR在不破坏细胞的前提下利用原位的完整细胞作为一个微反应体系来扩增细胞内的靶片断的方法，是一种把PCR和原位杂交结合起来的新方法。可应用于多种类型的研究材料（组织切片、离心细胞、悬浮细胞等）的不同拷贝数目序列（病毒的或基因组的DNA或RNA）的扩增。既有高度的敏感性，又有精确的定位。定量PCR主要利用加入PCR反应体系中的荧光基团或荧光染料来对扩增产物进行连续检测，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。已成功运用于水资源及居家办公环境中的大肠杆菌、藻青菌和一些寄生虫的检测；转基因生物鉴定和生物种类鉴定等方面。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应后不用电泳检测等。反转录PCR先用寡聚胸苷作为引物在逆转录酶作用下，反转录所有mRNA成cDNA，再用拟扩增片段两端的两段引物PCR扩增该段cDNA的方法。对表达信息进行检测或定量分析；测定基因表达的强度；鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性等。快速灵敏。多重PCR在一个反应管中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的方法。各类病原的检测与鉴别、遗传疾病诊断、以及基因缺失、突变和多态性分析等。能够同时检测多种目的DNA，节省样品，操作简单。但对条件要求较高，需优化。热不对称交错PCR利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物相组合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。用于分离获得克隆载体上的DNA序列，也能够用于基因组小的物种如拟南芥、水稻和基因组大的物种，如小麦以及哺乳动物的已知序列两侧翼的DNA序列的分离。操作简单，特异性高，高效灵敏，快速，不涉及连接反应，反应产物准确可靠，重复性好。但其需要的组合较多，而且有时存在假阳性。29HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 巢式巢式PCR技术技术 巢式巢式PCR原理示意图原理示意图巢式巢式PCR(nested PCR)，是，是指利用两套指利用两套PCR引物引物(巢式巢式引物引物)对对DNA模板进行两轮模板进行两轮PCR扩增反应。扩增反应。30HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 反向反向PCR技术技术反向反向PCR的原理示意图的原理示意图常规常规PCR是扩增两引物之间的是扩增两引物之间的DNA片段，反向片段，反向PCR（reverse PCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段。片段。31HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 原位原位PCR技术技术 原位原位PCR可应用于多种类型的研究材料（组织切片、离心可应用于多种类型的研究材料（组织切片、离心细胞、悬浮细胞等）不同拷贝数目的序列（病毒的或基因组的细胞、悬浮细胞等）不同拷贝数目的序列（病毒的或基因组的DNA或或RNA），扩增方法可分为单个或多个引物对，检测系统），扩增方法可分为单个或多个引物对，检测系统也分为直接和间接两种。也分为直接和间接两种。原位PCR的大致流程主要包括：a.染色体、细胞及组织切片样品的制备b.PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透c.PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用反转录PCRd.原位杂交及检测。32HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 定量定量PCR技术技术 定量PCR技术的方法主要包括：PCR产物的直接定量、有限稀释法、外对照PCR定量、内对照PCR定量、竞争性PCR定量以及荧光定量PCR。其中又以实时荧光定量PCR（Real time Fluorescent Quantitative PCR，RFQ-PCR）的方法应用最为广泛。33HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 实时荧光定量实时荧光定量PCR的两种定量技术原理的两种定量技术原理定量定量PCR技术技术 实时荧光定量实时荧光定量PCR的动态变化图（左）和标准曲线图（右）的动态变化图（左）和标准曲线图（右）34HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 反转录反转录PCR技术技术 反转录反转录PCR（Reversed Transcript PCR，RT-PCR），），是一种将是一种将cDNA合成与合成与PCR技术结合，用以分析基因表达的技术结合，用以分析基因表达的快速、灵敏的方法。快速、灵敏的方法。反反转转录录PCR原原理理示示意意图图35HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 热不对称交错热不对称交错PCR技术技术 热不对称交错热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，简称，简称TAIL-PCR）是一种用来分离与已知序列邻近的未）是一种用来分离与已知序列邻近的未知知DNA序列的分子生物学技术。序列的分子生物学技术。TAIL-PCR反应流程反应流程36HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 核酸探针杂交技术的应用核酸探针杂交技术的应用 分子杂交技术分子杂交技术(technique of molecular hybridization)又称又称核酸杂交技术，是利用现代分子生物学技术手段从分子水平探核酸杂交技术，是利用现代分子生物学技术手段从分子水平探讨组织细胞内特定基因的表达变化规律，并阐明细胞功能调节讨组织细胞内特定基因的表达变化规律，并阐明细胞功能调节机制的一种极为重要的方法，在一定程度上具有其他生物检测机制的一种极为重要的方法，在一定程度上具有其他生物检测技术所不能替代的作用。技术所不能替代的作用。37HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 常常规规分分子子杂杂交交技技术术的的定定义义及及分分类类菌落原位杂交分子杂交技术常规分子杂交技术荧光原位杂交技术生物芯片技术固相杂交液相杂交斑点杂交Southern 印迹杂交Northern 印迹杂交组织原位杂交夹心杂交DNA斑点杂交RNA斑点杂交完整细胞斑点杂交吸附杂交发光液相杂交液相夹心杂交复性速率液相分子杂交HAP吸附杂交亲和吸附杂交磁珠吸附杂交能量传递法吖啶翁酯标记法亲和杂交采用多组合探针和化学发光检测基因芯片蛋白质芯片芯片实验室其他类型生物芯片cDNA微阵列芯片寡核苷酸芯片技术组织芯片细胞芯片糖芯片38HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 菌落原位杂交菌落原位杂交 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出DNA与探针进行与探针进行杂交反应的方法。杂交反应的方法。用菌落原位杂交方法进行的用菌落原位杂交方法进行的FAST Plaque TB实验实验39HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY Southern印迹印迹Southern印迹杂交的操作流程印迹杂交的操作流程40HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 原位杂交原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)技术是用标记的核技术是用标记的核酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切片、酸探针，使用非放射检测系统或放射自显影系统，在组织切片、细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量细胞涂片及染色体制片上等对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。ANAMMOX污泥中浮霉状细菌荧光原位杂交分析污泥中浮霉状细菌荧光原位杂交分析41HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术的基本原理是基于碱基互补的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与待检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA相互补的核酸探针进行染色体水平上的原位杂交，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位。样品的固定样品的制备和预处理预杂交探针和样品变性用不同的探针杂交以监测不同的靶序列漂洗去除未结合的探针杂交信号的检测和结果分析FISH技术具体步骤技术具体步骤42HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术将中期细胞固定于玻片上将DNA变性成单链双链DNA探针荧光标记探针变性成单链探针与靶DNA杂交荧光检测图像获取和分析mFISH技术的实验路线图技术的实验路线图43HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术利用荧光原位杂交技术观测铁沉积样品中的微生物群落结构利用荧光原位杂交技术观测铁沉积样品中的微生物群落结构44HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 生物芯片技术生物芯片技术 生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞及蛋白质、核酸等生建微型生物化学分析系统，以实现对细胞及蛋白质、核酸等生物分子进行准确、快速、高通量检测。生物芯片的本质特征是物分子进行准确、快速、高通量检测。生物芯片的本质特征是利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化。生生物物芯芯片片各各部部分分高高度度整整合合45HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 生物芯片技术生物芯片技术生物芯片新技术及其优点生物芯片新技术及其优点核酸芯片相关的新技术核酸芯片相关的新技术优优 点点长链探针技术特异性和灵敏度较高凝胶微阵列芯片技术固定探针能力强，探针分子更易于与目标分子反应，生物兼容性好侵入式探针技术操作简便，恒温反应，费用低，准确性高，易于自动化和高通量操作捕获探针技术灵敏度高，分析时间较短，成本较低固相引物延伸技术灵敏度较高，易于高通量操作电子生物芯片反应效率较高，特异性较好LNA技术杂交特异性较好，生物学稳定性较高PNA技术更好的结合能力和更高的特异性46HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 生物芯片技术生物芯片技术基因芯片技术的原理基因芯片技术的原理 47HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 生物芯片技术生物芯片技术cDNA微阵列芯片原理图微阵列芯片原理图 48HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 生物芯片技术生物芯片技术核酸编程的蛋白质芯片制备原理核酸编程的蛋白质芯片制备原理 49HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术DNA指纹技术包括：指纹技术包括：变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE）温度梯度凝胶电泳（温度梯度凝胶电泳（TGGE）单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP）限制性片段长度多态性分析（限制性片段长度多态性分析（RFLP）末端限制性片段长度多态性分析（末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）核糖体基因间隔序列分析（核糖体基因间隔序列分析（RISA）扩增的扩增的rDNA限制酶切分析技术（限制酶切分析技术（ARDRA）随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析（分析（RAPD）50HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术DNA指纹图谱的建立过程示意图指纹图谱的建立过程示意图总总DNA提取流程示意图提取流程示意图 51HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 匹配指纹技术的电泳技术匹配指纹技术的电泳技术 分类依据分类依据名名 称称应应 用用分离对象蛋白质电泳研究蛋白质的理化性质及免疫学特征核酸电泳分离、鉴定及制备纯化核酸支持物琼脂糖凝胶电泳（图6-15a）分离、鉴定核酸及蛋白质聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳（图6-15b）分离、鉴定蛋白质及核酸醋酸纤维膜电泳分离、鉴定蛋白质自由溶液电泳分离、鉴定蛋白质及核酸电泳机理等电聚焦电泳分离、鉴定蛋白质，测定蛋白质等电点十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳（图6-15c）分离、鉴定蛋白质，测定蛋白质分子量双向电泳分离、鉴定蛋白质及细胞蛋白组成脉冲场电泳分离、鉴定及大病毒DNA免疫电泳分析、鉴定蛋白质的免疫学性质其它转印电泳蛋白质的免疫学分析及核酸的分子杂交鉴定毛细管电泳分离鉴定蛋白质、多肽、核苷酸、核酸及小分子化合物52HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图 53HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术聚丙烯酰胺电泳示意图聚丙烯酰胺电泳示意图 54HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 常见常见DNA指纹技术的比较指纹技术的比较方法名称方法名称基本原理基本原理基本步骤基本步骤特特 点点变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，进而导致DNA双链迁移速度的不同，将不同序列DNA片段分开，从而产生不同的指纹图谱。样品总DNA提取及纯化；样品16S rDNA片段的PCR扩增；预实验，对化学变性剂浓度范围进行确定；样品的DGGE分析。具有重现性强、可靠性高、速度快等优点，但该项技术具有对样品预处理过程要求较高、操作较为繁琐等局限性。温度梯度凝胶电泳（TGGE）TGGE技术的基本原理与DGGE技术相似，变性条件由不同浓度梯度的变性剂变成温度梯度。样品总DNA提取及纯化；样品16S rDNA片段的PCR扩增；预实验，对化学变性剂浓度范围进行确定；样品的DGGE分析。具有重现性强、可靠性高、速度快等优点，但该项技术具有对样品预处理过程要求较高、操作较为繁琐等局限性。单链构象多态性分析（SSCP）相同长度的DNA单链因其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，因而电泳迁移率不同而在凝胶中被分开，产生指纹图谱。样品总DNA提取及纯化；样品靶基因片段的PCR扩增；非变性聚丙烯酸胺凝胶电泳分离。具有操作简单；周期短；成本较低等特点，适合于大样本筛查等。扩增片段长度多态性分析（AFLP）对基因组酶切片段的选择性扩增，将获得的扩增片段通过琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出不同扩增片段长度的多态性。样品总DNA提取及纯化；双酶切及连接；PCR预扩增；PCR选择性扩增；变性聚丙烯酰胶胺凝胶电泳。具有效率、分辨率高；重复性好；操作简便；样品用量少、适用性广等特点。但存在技术费用昂贵、对模板反应迟钝、在对等位基因的精确定位等方面存在一定的局限性。末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）微生物群落中任何具有特异性的DNA片段都可以作为目标分析序列，包括微生物核糖体小亚基（SSU）16S rRNA（原核生物）和18S rRNA（真核生物）的基因序列，以及一些保守的功能基因序列等。通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析微生物群落结构和功能。样品总DNA的提取；PCR扩增PCR扩增产物的限制性酶切；变性聚丙烯酸胺凝胶电泳分离。具有分辨率高、易于实现自动化等特点。但存在PCR差异性、无法准确的分析较大量生物信息等局限性。55HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 常见常见DNA指纹技术的比较指纹技术的比较核糖体基因间隔序列分析（RISA）细菌16S和23S rDNA间隔片段（ITS）的大小可因不同的物种而变化，利用PCR将ITS扩增出来，并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，即可产生RISA指纹图谱。样品总DNA的提取；ITS序列的PCR扩增；用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩 增产物及解析图谱。具有简单经济；易操作等特点。但同时存在精度较差等缺点。扩增的rDNA限制酶切分析技术（ARDRA）一定长度的DNA经某种限制性内切酶消化后，产生若干不同长度的小片段，其数量和每一片断长度反映了DNA上该限制性内切酶酶切位点的分布。这些不同的片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，根据其显示的带型，可以判断样品间的差异。样品总DNA提取及纯化；PCR扩增；限制性酶切；用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离酶切的 DNA片段并解析图谱。具有特异性强、效率高的特点。随机扩增多态性DNA分析（RAPD）利用一系列随机引物，以DNA为模板，通过基因放大器进行多态性DNA片段的随机合成。样品总DNA提取及纯化；随机性PCR扩增；用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并 解析图谱。具有效率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点。扩增功能DNA限制性分析（AFDRA）对基因组中功能基因的选择性扩增，利用限 制性内切酶对功能基因进行酶切，后利用琼脂糖凝胶电泳分离得到酶切片段多样性图谱，以判断功能基因的多样性。样品总DNA提取及纯化；利用设计的特异性引物对功能基因进行 PCR扩增；限制性酶切；用含有Nusieve（FMC的生物产物）的琼 脂糖凝胶矩阵分离酶切的DNA片段并解 析图谱。专用于功能基因多样性的分析，具有效率高、特异性强、检测灵敏度高等特点。但引物的设计对结果影响较大，预实验较为繁琐。56HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(DGGE)DGGE的原理是：在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降，因此，将PCR扩增得到的等长DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，以至停留在其相应的变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带，每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同序列的DNA。57HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术不同偶氮染料脱色菌群的不同偶氮染料脱色菌群的DGGEDGGE指纹分析图谱指纹分析图谱58HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 温度梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳(TGGE)DNA指纹图谱技术指纹图谱技术TGGE技术的基本原理与DGGE技术相似，含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离PCR产物及目的片段。大熊猫面部菌群的大熊猫面部菌群的TGGE图谱图谱59HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP）DNA指纹图谱技术指纹图谱技术 PCR-SSCP技术是技术是1989年日本关谷实验室将年日本关谷实验室将PCR反应与反应与单链单链DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合而创立的。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合而创立的。活性污泥体系的活性污泥体系的SSCP指纹图谱指纹图谱60HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 扩增片段长度多态性分析（扩增片段长度多态性分析（AFLP）DNA指纹图谱技术指纹图谱技术 扩增片段长度多态性（AFLP）是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法，它可以检测整个生物基因组的多态性。引物组合引物组合E7P16230在在F2群体检测结果群体检测结果61HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术末端限制性片段长度多态性分析（末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）末端限制性酶切片段长度多态性分析（末端限制性酶切片段长度多态性分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）是）是RFLP基础上发展起来的新技术，相对基础上发展起来的新技术，相对于其它分子生物学技术具有分辨率高、易于实现自动化等特点，是分析复杂于其它分子生物学技术具有分辨率高、易于实现自动化等特点，是分析复杂环境微生物群落的强有力的工具之一。环境微生物群落的强有力的工具之一。用土著菌株及外来菌株对活性污泥体系进行生物强化的用土著菌株及外来菌株对活性污泥体系进行生物强化的T-RFLP指纹图谱指纹图谱62HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术核糖体基因间隔序列分析（核糖体基因间隔序列分析（RISA）核糖体基因间隔序列分析（Ribosomal Intergentic Spacer Analysis，RISA）技术是以细菌16S和23S rDNA间隔片段（ITS）为研究对象。这种间隔区的大小可因不同的物种而变化，即使对于同一种菌中的不同株，其ITS的长度和序列可能不同。这些序列普遍是不保守的，即使是在亲缘关系很近的情况下往往仍表现出显著的序列差异，尤其是长度特异性，而这种序列的变化理论上可以表现出较大的多样性。63HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术生物强化活性污泥体系处理溴氨酸废水的生物强化活性污泥体系处理溴氨酸废水的RISA指纹图谱指纹图谱64HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术扩增的扩增的rDNA限制酶切分析技术（限制酶切分析技术（ARDRA）扩增的扩增的rDNA限制性酶切片段分析技术（限制性酶切片段分析技术（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA）是上个世纪末发展起来的一）是上个世纪末发展起来的一项现代生物技术，此方法由于不受菌株是否纯培养的限制，不受项现代生物技术，此方法由于不受菌株是否纯培养的限制，不受宿主的干扰，具备特异性强、效率高的特点，因此广泛适用于研宿主的干扰，具备特异性强、效率高的特点，因此广泛适用于研究共生菌、寄生菌的生物多样性情况和系统发育关系。究共生菌、寄生菌的生物多样性情况和系统发育关系。生物强化活性污泥体系处理溴氨酸废水的生物强化活性污泥体系处理溴氨酸废水的ARDRA指纹图谱指纹图谱65HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY DNA指纹图谱技术指纹图谱技术扩增功能扩增功能DNA限制性分析限制性分析(AFDRA)扩增功能扩增功能DNA限制性分析（限制性分析（Amplified functional DNA restriction analysis，AFDRA），是一种针对功能基因多样），是一种针对功能基因多样性分析的新型性分析的新型DNA指纹技术。指纹技术。C23O(邻苯二酚邻苯二酚2，3双加氧酶双加氧酶)AFDRA指纹图谱指纹图谱66HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY 城市水资源与水环境国家重点实验室黑龙江省环境生物技术重点实验室 欢迎您！欢迎登陆：http:/ 谢谢！67