高级植物生理学课件第5章植物钾营养分子生理.ppt

第六章 植物钾营养分子生理,Zichao Mao ,Why potassium is important,Potassium (K) play key roles in physiological and biochemical processes, which greatly influence the growth and development of plants. Particular physiological processes affected substantially by inadequate supply of K (1) partitioning of carbohydrates between roots and shoots; (2) photosynthetic carbon metabolism; (3) formation of reactive O2 species and related photooxidation; (4) regulation of stomatal activity and water regime; (5) tolerance against biotic and abiotic stress factors, such as salt stress and drought stress.,1钾离子是植物细胞中含量最丰富的阳离子之一。它的功能： K+能促进细胞内酶的活性。细胞内有50多种酶或完全依赖于K+ ，或受K+的激活，如丙酮酸激酶、谷胱合成酶、6-磷酸果糖激酶等能被K+激活。作用方式为：同其他一价阳离子都是通过诱导酶构象的改变，使酶得到活化，从而提高催化反应的速率。在某些情况下K+能增加酶对底物的亲和力。K+对膜结合ATP酶也有激活作用。,2.K+与蛋白质的合成有关。小麦胚芽中分离出的核糖体，合成蛋白质达到最佳速率时，其所需K+浓度为130mM。 3 K+可能参与tRNA与核糖体结合过程中的几个步骤。,Mineral nutrition of plants,-P,-K,-N,-S,-Ca,-Fe,-Mg,Plants need elements other than C to grow and develop,Must integrate carbon with other inorganic minerals taken up by roots from environment Together, these elements are the building blocks of complex molecules (proteins, nucleic acids, etc.) Mineral (inorganic) nutrition dependent on C metabolism and vice-versa Need for understanding how plants gain nutrition from environment People no longer grew their own food! Need to optimize growth conditions to feed more people central role of NPK fertilizer to boost yield,Hydroponic growth facilitated the discovery of essential mineral nutrients,Further definition of “essential”: Sachs (mid-19th century) used hydroponic culture now used for vegetable production roots are cultured in solution, not in soil More modern growth media Hoaglands solution now slightly MODIFIED Murashige and Skoog (M + S) Solutions have high nutrient levels relative to soil Required because the supply is often not replenished frequently Hydroponic culture can be as simple as a plant supported in an aerated pot If roots waterlogged, what happens to yield?,Ca N K S Mg P Fe B Mn Zn Cu Mo,Main disadvantage of simple solution culture as plant grows, it selectively depletes certain minerals When one becomes limiting, growth will slow significantly Can grow in vermiculite/perlite (inert, non-nutritive) and refertilize daily Commercially, it is often cheaper and easier to continuously bathe roots in a nutrient solution (nutrient film technique) Aerates Standard nutrient level maintained Continuous process monitoring To define “essential”, researchers need inert materials contributing low levels of nutrients (NO METAL PARTS!),Fig. 12.1,Fig. 12.2,Hydroponic culture techniques come in different flavors,There are 17 essential elements required for plant growth,What defines an “essential” element? In its absence the plant cannot complete a normal life cycle The element is part of an essential molecule (macromolecule, metabolite) inside the plant Most elements fall into both categories above (e.g., structural vs. enzyme cofactor) These 17 elements are classified as 9 macronutrients (present at 10 mmol / kg dry wt.) 8 micronutrients ( 10 mmol / kg dry wt.) Environmental (silicon dust) and/or cultural (from equipment, water, impure salts) contamination make assigning “essentiality” difficult Essentiality of micronutrients (0.11 ug/L!) especially difficult to establish Difficult to detect low concentrations push detection limit of common analytical techniques (e.g., flame spectrometry),The availability of some minerals to the plant for growth is dependent on environmental conditions,There may be high levels of nutrient present in soil but it is not in a metabolically useful form e.g., Fe Need to supply a lot Dependent on pH (precipitates out of solution) Fe2+ more bioavailable (soluble) Many plant “diseases” are actually mineral deficiencies (common: Mn, B, Cl) Some inessential elements are still beneficial to plant health required at sub-micronutrient concentrations Na (in C4 plants involved in transporting C between bundle sheath and mesophyll cells) Si (in cell walls; prevents lodging) Co (by N-fixing bacteria),The absence of essential elements causes deficiency symptoms,Essential because of their metabolic functions Characteristic deficiency symptoms shown because of these roles Typical deficiency responses are Chlorosis: yellowing; precursor to Necrosis: tissue death Expressed when a supply of an essential metabolite becomes limiting in the environment Element concentrations are limiting for growth when they are below the critical concentraion This is the concentration of nutrient in the tissue just below the level giving maximum growth,Concept of critical concentration illustrated,Above critical concentration, there is no net benefit (e.g., yield increase) if more nutrient is supplied Below critical concentration, nutrient level limits growth! Not shown on diagram: all elements eventually become toxic at very high concentrations This is more common for micronutrients in polluted environments,“HEAVY METAL” contamination,Fig. 12.3,Limiting nutrient levels negatively affect growth,Plant responses to limiting nutrients usually very visible: affects yield/growth! Again, chlorosis and necrosis of leaves is typical Sometimes straightforward relationship e.g., in chlorosis, N: chlorophyll component Mg: cofactor in chlorophyll synthesis,Fig. 12.4,Sometimes NOT Symptoms dependent on species and nutrient mobility,Ctrl,- P,- Ca,- N,- Fe,Lets briefly discuss cellular roles and deficiency symptoms for the big 3 essential elements,N: Abundant in atmosphere but metabolically unavailable to non-legumes Usually absorbed as nitrate (NO3-) and reduced to ammonia (NH4+) in the plant Agronomically, N is always limiting There is a direct relationship between N supplied and yield! Component of proteins, NAs (bases), PGRs, chlorophyll Symptoms of deficiency: slow growth, leaf chlorosis Mobilized from older leaves to sinks as soluble amines NH3 and amides Therefore, older leaves show first signs Also accumulate anthocyanin pigments because C skeletons cant make chlorophyll, amino acids, etc. (no N!) This is a typical nutrient stress response!,O C,N,CH3,CH3,Rost et al. “Plant biology”, 2nd edn,Phosphorus is the most limiting element in natural environments,P: Present in soil as phosphoric acid ( H3PO4 ) pH 6.8: H2PO4- orthophosphate most bioavailable form Deprotonated at higher pH less available PO4 tends to precipitate and form unavailable complexes with Metals Organic molecules Present at 1 M in most soils it is the most limiting element for plant growth! Component of Hexose-P Nucleotides (P-backbone) ATP! Symptoms of P deficiency include Reduced yield, short stems Intense green colour Anthocyanin synthesis Mobilized from sources to sinks (young leaves) as for N,Rost et al. “Plant biology”, 2nd edn,Potassium is essential for controlling plant cell size,K: Most abundant cation Supplied as potash: K2CO3 High solubility, leaches from porous soils Biochemical functions: Enzyme cofactor - activates enzymes of photosynthesis and respiration (pyruvate kinase in glycolysis) An osmoregulator in vivo controls cell size e.g., guard cell H2O uptake controls stomata size Balances charge of anions like Cl- Mobile - often leaves show deficiency first Symptoms- chlorosis, necrosis, lodging of stems,Rost et al. “Plant biology”, 2nd edn,V shape comes forth along tip and margin of leaves. And brown spots appear on old leaves.,缺钾症状,玉米缺钾症状,K Deficiency,Normal,Small leaves of Tobacco,Yellowing leaves of Cabbage when K defected,Etiolation from margin of leaf, some brown spots and white dry tissue on rape when potassium defected.,Small white spots appear on margin of old leaves,Spinach K deficiency,Leaves appear dark green, and tip and spots come forth on the margin leaves, which are brown and purple death tissue. Tender stem is thin and length.,K deficiency K abundance,Much flower when,Comparison on Almond(杏 ),Leaves of Chestnut(栗子),Color of the flowers is light, and some irregular white spots on surfaces of leaves on carnation,chrysanthemum,Pink,一、转运途径 1 真核生物细胞膜上存在Na+ - K+ ATPase，高亲和K+吸收转运体和组织特异性的K+通道。 2 原核生物中至少有4种功能上独立的K+转运系统。,6.1 生物膜与K离子转运,二、研究方法：膜片钳技术,它是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。自1980年以后，此技术已可用于很多细胞系研究。它点燃了细胞和分子水平的生理学研究的热火，其和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。这一伟大贡献，使Neher 和Sakmann获得了1991年度诺贝尔生理学与医学奖。,三、钾的吸收形态：以离子态被植物吸收。植物吸收K+需要通过质膜上的转运蛋白(membrane transport protein)来实现。 1 膜转运蛋白：载体蛋白(carrier protein，亦称为载体或转运体，transporter)和通道蛋白(channel protein)。载体蛋白与特定的离子结合，发生构象(conformation)变化，把离子转运过质膜。通道蛋白穿过脂双层形成水通道。当这些通道打开时，允许特定的离子越膜通过。通道蛋白允许离子通过其所形成的水通道作被动运输；而载体蛋白既可以与与离子相结合，顺其电化学梯度进行被动运输，也可以逆其电化学梯度进行主动运输。,2 离子的跨膜运输： 被动运输(passive transport)和主动运输(active transport)。 被动运输； 由扩散作用或物理规律所决定的运输 主动运输 逆浓度梯度(reverse concentration gradient)或电位梯度(electrical gradient)运输，需要消耗能量，与能量代谢相偶联。 转运蛋白中，通道蛋白的转运效率高1 x 106-8/s, 。 转运体每次转运循环只能转运一个或几个离子，转运需要通过转运蛋白的构象改变而实现，转运效率低，一般转运速度为1 x 103 /s,三、植物对K+的吸收机制 植物对K+的被动吸收主要通过K+通道完成。主动吸收通过载体蛋白来完成。 植物对K+的吸收以主动吸收为主。 在低浓度下吸收速率随外界钾浓度加大而迅速增加； 当浓度较高时，增加单位浓度引起的变化减小，达到最高浓度时，钾的吸收实际上已与钾的浓度无关。,Epstein和Hagan把离子与载体的结合看成形式上相当于酶与其底物间的关系。把载体蛋白比作酶分子，离子比作酶底物。使用不同的底物，可观察到饱和现象。离子的运输速率取决于： （ 1 ）容量因子。即当载体有效位点满负荷时的最高运输速度，也称为最大运输速率，用Vmax表示。 （2）强度因子。是指在一定浓度下，载体真正负载的那部分。,即“米氏常数”Km，相当于最大运输速率50时溶质中离子的浓度。Km值越低，即形成最大吸收速率一半时的离子浓度越低，意味着载体场位对离子的亲和力越大。当外界K+浓度范围较高时， K+的吸收速率会大大超过低K+浓度范围时计算的最大值。 K+的高亲和吸收：钾离子以载体为媒介的转运机制是在低浓度范围内活动的，即媒介载体在低浓度时起作用的，能使钾离子仍能得到很好的吸收以满足植物生长发育需要的机制。,在高浓度K+ 150mmol/L）时的吸收属K+的低亲和吸收。 高亲和吸收服从简单的Michaelis-Menten动力学方程，具有特异的选择性。Na+或其他阳离子（Li+ 、Ca+ + 、Mg+ + ）在这个机制作用下，是不能有效地和K竞争的。 低亲和吸收受到其他阳离子（如 Na+ 、Ca+ + ）的干扰，不表现高度的专一性。 为什么高亲和不受其他阳离子的干扰，而低亲和吸收却会受到其他阳离子的干扰呢？,四、钾离子通道类型、特征与功能,1离子通道是跨膜蛋白 每个蛋白分子能以每秒钟106108次的速度进行离子的被动跨膜运输，离子在跨膜电化学势梯度的作用下进行的运输，不需要加入其他任何形式的自由能。电化学势梯度包括化学势梯度和电势梯度两方面，离子的运输方向取决于这两种梯度的大小。膜两侧的化学势与电势间的关系可用能斯特（Nernst）方程式表示：,2离子通道有两个限定属性 （1）通道对离子具有选择性， 离子通道常常用通透性最高的离子或这些离子所引起的生理现象来命名。但是，这种选择性也非绝对的，如有些K+通道不仅仅允许K+通透，还允许一定程度的Na+ 通透。确定通道对离子的选择性顺序通常有两种方法。,A通过测量不同离子通过通道时的电导。不同离子通过通道时的电导，是一定的离子浓度和一定的膜电位条件下，离子跨膜产生的电流。产生的电流越大则对此种离子的通透性越大。 B 测定不同离子存在时的反转电位（reversal voltage）(即离子跨膜产生净电流为0时的细胞膜电位)。利用这两种方法得出的通道对离子的选择性顺序并不一定是一致的，在很多生理条件下，它们能得出不同的选择顺序。,（2）离子通道符合“有或无”法则，即它只存在“关闭”或“打开”两种状态（即允许离子通透或不通透）。离子浓度或跨膜电势的变化会引起离子通道状态发生改变，导致通道激活（activate）而打开或通道钝化（deactivate）而关闭。,3. K通道的类型 （1）根据通道对电势依赖性及离子流方向可分为：内向整流K通道（inward-rectifying K channel： K in）；外向整流K通道（outward-rectifying K channel： K out）。 （2）根据通道对刺激的反应快慢及对配基的依赖性可分为：延迟的K通道（delayed K channel）；早K通道（early K channel）；Ca+激活K通道（Ca+activated K channel）；ATP激活的K通道等。 在植物中主要鉴定出内向整流K通道和外向整流K通道。这两种通道具有不同的动力学特征，通常认为是两种蛋白，均具有电势依赖性。这两种K通道存在于各种植物细胞膜中，如保卫细胞、糊粉层细胞、叶片细胞、茎组织、叶肉细胞和中柱细胞等。,4植物内向整流K通道（ K in）的特征 （1）位置：植物内向整流K通道（ K in）主要是存在于细胞的质膜上，具有特殊的电势依赖性。,静息电位是细胞质膜内外相对稳定的电位差，质膜内电荷为负值，质膜外为正值，这种现象又称极化（polarization）。 静息电位主要是质膜上相对稳定的离子跨膜运输或离子流形成的。在多数细胞中静息电位的大小主要由Na和K在质膜两侧不同的浓度分布来决定，质膜对K的通透性大于Na是静息电位产生的主要原因。Cl-及细胞中的蛋白质分子（一般为静电荷为负值）对静息电位的大小也有一定的影响。,当刺激信号（电信号或化学信号）超过一定阈值时，引起Na通透大大增加，瞬间大量Na流入细胞内，膜电位减少乃至消失，即为质膜的去极化过程（depolarization）。Na平衡电位，形成瞬间的内正外负的激活电位，称质膜的反极化，激活电位随即达到最大值。只有达到一定的刺激阈，激活电位才会出现。这是一种全或无的正反馈K通道完全打开。 K通道是一种电压通道， K流出细胞从而使质膜再度极化，以至于超过原来的静息电位，此时称超极化（superpolarization）。超极化时膜电位使K通道关闭，膜电位又恢复静息状态。,（2）植物内向整流K通道的开启与关闭机制： K in通道在细胞膜超极化（hyperpolarization）的电压条件下被激化打开，即在跨膜电势很低时被打开，引起胞外的K流入胞内。Schoreder （1991）分离34周龄菜豆（V.faba）的保卫细胞原生质体，进行全细胞膜钳试验发现，保卫细胞原生质膜在-100mV更负的电位及细胞外具有11.25mmol/L的K浓度时， K内流离子通道被激活。随着K浓度的降低，内流电流减弱，当K浓度为0时，内流电流消失。,降低细胞外K浓度，激活K in通道所需膜电位更低。通过在不同细胞外K浓度条件下，测定K的传导率，引入米契利斯门藤（Michaelis-Menten）方程计算出通道对K的吸收动力学特征，其Km为3.5mmol/L，符合低亲和K的吸收的特性。证明这种内流K通道是对K浓度敏感的、依赖电压的，对K亲和力低的通道。这种内流K通道对细胞膜电位及外界K的依赖性在其他作物中也已发现。,（3）对一价阳离子吸收的选择性：它对K有高度的选择性，对一价阳离子的选择性吸收顺序为K Rb+NH4Na+Li+Cs+。动力学分析的Km为8mmol/L。,5 植物外向整流K通道（ K out）的特征 （1）位置： K out通道存在于植物的各类细胞的质膜中。 （2）开启与关闭机制：在细胞膜去极化（depolarization）的条件下，它被激活打开，此时的跨膜电势比较高，导致K由胞内排出到胞外。当膜电位去极化-40mV时， K out通道被激活，产生K外流。Schroeder 等（1987）推算每个保卫细胞原生质膜有近103个K外流通道。分离菜豆叶片下表皮保卫细胞，进行电压钳位试验，测得细胞内K浓度为105mmol/L，细胞外K浓度为12mmol/L时，细胞的静息电压为-60mV，在钳位电压升到-40mV以上时，产生大量的外向电流，而在超极化电位条件下，诱发内流电流产生。,（3）外向整流K通道的种类： A. 在动物细胞的质膜上已鉴定出一系列外向整流K通道，称为Shaker超家族（Shaker superfamily）。该类型K通道是由4个亚基组成，每个亚基分子质量约为65100kDa之间，4个亚基上的P-区域（P-domain）排列形成通道孔（Hille 1992；Jan and Jan 1992），每一个亚基具有6个跨膜区域S1，S2，S3，S4，S5，S6。S4区域包含有几个带正电荷的氨基酸，对膜电压较敏感，称为电压敏感区。P区域形成通道孔的一部分， 对于通道的选择性具有非常重要的作用。动物细胞上的K通道也存在亚基，亚基为改变K通道的特性提供了新的机制，它能通过调节通道蛋白的失活来调节通道的特性；,B. 植物细胞中K通道结构与动物的K通道Shaker超家族结构类似，也是由亚基组成，也存在着亲水性的类似于动物的亚基，对通道的活性进行调节。 如拟南芥中有一个KAB序列相当于动物K通道上的亚基，其分子质量33kDa，与拟南芥K通道KAT的亚基紧密结合，调节通道活性。,6.2 植物K通道的功能 一、 K通道对膜电势的调节 不同方式的物质跨膜运动，其结果是产生维持了膜两侧不同的物质浓度梯度。对离子来说，就形成了膜两侧的电位差。玻璃微电极插入细胞可测出细胞质膜两侧的各种带电物质形成的电位差的总和，即膜电位。这类测定首次是在巨型藻类细胞中进行的，检出的细胞膜负电势高达-100-200mV。细胞膜电位种类：一种称为静息电位（resting potential），在该电位条件下，没有离子的转运；另一种是激活电位（active potential），即在刺激作用下产生并行使通讯功能的快速变化的膜电位。,二、Na K泵对静息电位相对恒定也有重要的作用 因为Na K泵能维持细胞内高K低Na的内部环境，使细胞具有相对稳定的膜电位。 Na K泵的组成：它由和两个亚基组成，亚基的分子量为120kDa,是一个跨膜多次的整合膜蛋白，具有ATP酶活性。亚基分子质量为50kDa,是一种具有组织特异性的糖蛋白。,Na K泵的工作模式：在细胞内侧亚基与Na相结合促进ATP水解，亚基上一个天门冬氨酸残基磷酸化引起亚基构象发生变化，将Na运出细胞，同时细胞外的K与亚基的另一个位点结合，使其去磷酸化，亚基构象再度发生变化将K输入细胞，完成了整个循环。每个循环消耗一个ATP分子，转运3个Na和2个K 。,综上所述，膜电位与质膜对K和Na的不同透性有关，而且质膜上的Na、 K通道蛋白及Na -K泵等膜蛋白随膜电位变化有规律地关启。,6.3 K通道与植物K营养吸收转运 一、植物根系对K 的吸收转运有两种机制 高亲和K吸收（high affinity K uptake）与低亲和K吸收（low affinity K uptake）(Maathuis and Sanders 1996)。高亲和K吸收主要依靠转运体来完成，是一种主动吸收过程。低亲和K吸收主要通道K内流通道完成。 K通道蛋白对K吸收的Km为316mmol/L，细胞外界K浓度300mol/L。,Findlay和Gassmann于1994年分别在小麦根毛和表皮细胞中观察到典型的K in通道电流，其Km为8.8mmol/L。这与低亲和K吸收动力学特性相一致。研究发现小麦根毛中的K in通道能被Al3所抑制（Gassmann 1994）。铝对植物毒害的主要生理机制是抑制根的生长，影响根系对阳离子的吸收。铝抑制K in通道，从另一方面也证明了K in通道是低亲和K吸收的主要途径。,二、 K in通道对离子吸收具有两种功能 K in通道为低亲和K吸收提供了一条途径，其吸收过程受H-泵建立的跨膜电势的驱动； K in通道通过感受胞外与胞内之间的K浓度梯度，调整膜电导而控制溶质的跨膜运输，影响其他运输系统对营养物质的吸收。,6.4 K通道与木质部的运输,植物根系吸收的养分到达地上之前需要被转运到木质部。木质部导管周围的木薄壁细胞中的质子泵、水通道和离子通道对离子或溶质在木质部的载入和卸出起着重要作用。大麦的木薄壁细胞质膜中有三类阳离子通道。外向整流传导的K通道（KORCK+：outward-rectifying conductance，等于K out通道）、非选择性外向整流传导K通道（NORC：nonselective outward-rectifying conductance）及内向整流传导K通道（KIRC： K inward-rectifying conductance，等于K in通道）。,KORC及NORC通道负责离子载入木质部，分别在跨膜电势高于-50和+30mV时被激活。NORC通道对阳离子无选择性，与胚乳细胞中描述的外向整流通道类似（Stoeckel and Takeda 1989）。KORC和NORC通道能共同存在于同一个细胞中，它们的激活都依赖于胞内Ca2水平。根系中，当质子泵的活力减少和（或）阴离子通道激活引起阴离子释放到木质部时，导致膜的去极化，激活Kout通道，Kout通道将K释放出到木质部。,在以上描述K 通道作用时，我们都没有考虑植物细胞中的液泡对生理过程的影响。液泡作为植物细胞的一个重要组成，它积累了胞内95的K ，是细胞膨胀和萎蔫的结构基础。在大多数情况下，液泡对K 的吸收是主动运输，而液泡内K的释放被认为是由K通道调整的。已经证明液泡膜中存在有三种K通道：,（1）SV（slow-activated vacuolar）通道 它对阳离子无选择性，允许K进入液泡； （2）是VK(vacuolar K )通道 它对K具有高度的选择性，并且是电势依赖型的通道。VK通道能引起K由液泡内向胞质中释放； （3）FV（fast-activated vacuolar）通道 与SV通道类似，对阳离子无选择性，主要引起阳离子从液泡向胞质中释放，并提高胞质部分的渗透压。这些通道使得胞内部分成为一个整体，直接对外部刺激反应。,综上所述， K通道在高等植物中参与大量的生理反应过程。其中， K in通道的功能可概括为： 1）在保卫细胞及不同类型植物细胞的膨胀、运动和生长过程中介导的K的吸收。 2）通过在根细胞上形成一种低亲和性的吸收途径进行K的营养吸收和运输。 3）将阳离子从木质部释放到共质体中。 4）进行跨膜电势的调整，如阻止膜的过度超极化。,Kout通道的功能可概括为： 1）进行跨膜电势的调整，如阻止膜的过度去极化。 2）释放溶质行使生理功能，如造成气孔的关闭、组织运动和渗透压的调整等。 3）阳离子载入木质部。,6.3 植物K营养的高亲和吸收特性,一、 KH的协同完成K的运输 植物细胞通常处于低K的环境条件下（在mol/L范围内），在此条件下植物细胞质膜依靠高亲和K转运系统吸收外界环境中的K。高亲和K转运系统主要由高亲和K转运蛋白组成。,二、KNa共转体作用影响K的吸收 Rubio（1995）研究HKT1对K吸收的分子机制指出，K的吸收也是在KNa共转体作用下进行的，HKT1有两个离子结合位点，一个是K结合位点，一个是Na结合位点。HKT1对K是高亲和吸收（Km为3mol/L），对于Na是低亲和吸收（Km为175mol/L），当Na浓度过高时会抑制K的吸收，即Na与K竞争与通道蛋白K结合位点。这表明HTK1是一个对碱性阳离子非选择性吸收的双向转运蛋白。因此，在高盐浓度下，植物会受到钠盐的毒害。,6.4模式真核生物酵母的K转运的研究,一、 酵母K吸收转运功能缺失突变体的分离鉴定,1K吸收转运机制：低亲和K吸收转运（Km为2mmol/L）。细胞在2mmol/L K浓度范围内生长K吸收转运体进行，最大吸收速率为7nmol/(mg.min)。高亲和K吸收转运（Km为24mol/L）,在 K缺乏条件下K吸收依赖高亲和转运，最大吸收速率为34nmol/(mg.min)（Rodriguez et al.1984；Anderson et al.1995）。,2 功能突变体的分离及鉴定：Ramos等（1985）用EMS（ethyl methanesulfonate）处理酵母细胞株系XT3000.3A（MAT, ade2-1）, 筛选高亲和K吸收转运体基因缺失突变体（能在100mmol/LK介质中生长，不能在1mmol/LK中生长的细胞）。由此筛选到的一个突变体记为PC-1。,在精氨酸磷酸盐培养介质中，两者生长达最大速度一半时，需K浓度相差两个数量级，野生型及突变体的需K量分别为2mol/L及3mmol/L。当野生型及突变体保持相同的生长率时，尽管需要的生长介质中K的浓度不同，但细胞内K的含量相似。随着胞外K的浓度降低，细胞的生长速率降低，细胞内K的含量也降低。,二、酵母高亲和K吸收转运基因trki的分离鉴定,酵母细胞内外K浓度差异可达1000倍，如酵母细胞在5mol/L K的介质中生长，细胞内K的水平可达到近150 nmol/L（Bost 1981）。这种现象说明酵母细胞质膜上存在着产生和维持K浓度梯度的蛋白。已发现在酵母细胞质膜上存在质子泵 (Serrno 1984)，至少一类K通道和负责K吸收的转运系统。他们之间的关系需要进一步鉴定，但有证据表明它们在功能上是相互独立的。在K胁迫下，通过体外得到驱动质子跨膜和ATP-ADP交换的质子泵H+-ATPase；鉴定到酵母K高亲和转运体基因trkl.,酵母K吸收转运功能缺失的突变体不能在低K的介质中（1 mmol/L）生长。野生型细胞达最大生长率需介质K浓度小于1 mmol/L，突变体trk1-1达最大生长速率需介质K浓度为510mmol/L。 用野生型酵母基因组克隆（构建于穿梭质粒YCp50）转化突变体，凡能使突变体恢复在低K介质中生长的克隆，便是包含有高亲和K吸收转运体基因trk1的克隆-（功能互补）。,含trk1基因的4.2kb碱基序列分析表明，trk1基因阅读框有3705bp。编码1235个氨基酸的多肽，分子质时141kDa。该蛋白共包含有12个由2022个疏水氨基酸组成的跨膜结构区，N末端的40个氨基酸也组成一个疏水性结构， 但似乎不组成跨膜结构。TRK1蛋白序列10441058的氨基酸序列：NNNNNNNRKKKKKKK和第15001545的氨基酸序列：DMDDDDDDDDNDGD形成了trk1表达蛋白的两个高度带电荷区域，可能形成对电压敏感区。没有发现TRK1蛋白氨基酸序列与任何其他蛋白有大范围的同源序列，但是与一些小而有重要意义的蛋白氨基酸序列同源。,TRK1与加利福尼亚鱼雷（torpedo californica）的乙酰胆碱受体亚基的氨基酸序列，大肠肝菌kdpC基因编码的K转运ATPase酶的氨基酸序列有部分同源性。在乙酰胆碱受体亚基的20个氨基酸序列中有7个氨基酸组分与TRK1同源，这7个同源氨基酸包括不常见的色氨酸和两个相邻的组氨酸残基。大肠杆菌K转运ATPase的22个氨基酸序列中也有7个氨基酸与TRK1同源。这两种蛋白都涉及到阳离子的转运。,TRK1与它们有同源性具有非常重要的意义。TRK1与其他许多原核或真核生物的核苷酸结合蛋白具有同源性，如TRK1的第735739氨基酸GSGKT与其他核苷酸结合蛋白具有45个相同氨基酸残基。这一结构中的Gly是非常保守的，在所有比较的序列中，序列GXXGXGKT除UvrD（大肠杆菌的一种蛋白）和EfG（大肠杆菌的一种蛋白）外，各蛋白间高度保守。,氨基酸亲和性作图分析（hydropathy plot）表明TRK1有12个疏水片段，可形成12个跨膜结构。位于S3和S4之间有一段650个氨基酸长度的亲水区。虽然此部分含有80的TRK1蛋白甲基化位点，到目前为止还没有实验方法证明该亲水区是胞内的还是胞外的。其他蛋白，如细菌ATPase和乙酰胆碱受体的650个氨基酸长度的亲水区通常认为是胞内的。根据TRK1的氨基酸序列及其亲水性作图分析，推测TRK1的蛋白结构模型。,TRK2是基因组分析出的确TRK1同源基因，突出物可能是起源于同一祖先或是由于基因重复造成的。 TRK1与TRK2两者在结构上存在以下差异：,1)TRK1的S3与S4之间有650个亲水氨基酸，而TRK2减少为334个氨基酸，而且在这一区域两者的氨基酸序列几乎不相关。 2)TRK1从1040氨基酸位开始有27个亲水氨基酸，而TRK2却减少为7个。 3)TRK2比TRK1的羧基端少13个氨基酸。,4)TRK1中位于S3和S4之间的一个假设的核苷酸结合区GSGKT，TRK2缺失与TRK1完全不同。 5)TRK1的14个糖基化位点在TRK2中只有两个（606801）。 6)TRK1的10个半胱氨酸，在TRK2仅有4个（分别位于第463，584，760，762个氨基酸位置）。这表明TRK1与TRK2虽是非常相似的K转运蛋白，但结构上的细微差异，决定了其功能上的不同。,通过K吸收缺陷型酵母细胞的功能互补法（functional complemention），从拟南芥中克隆出两类不同的K通道cDNA，分别被命名为akt1和kat1(Anderson et al.1992；Sentenac et al.1992)。根据这两个基因编码的蛋白氨基酸序列及蛋白结构上的一些特征，人们推测AKT1和KAT1是“Shaker”超家族（“Shaker” superfamily）的成员。,对AKT1和KAT1的测序结果表明，它们有6或7个跨膜结构域。在第5和第6个跨结构域处有一个P-区域，它被用来组成离子通道的通道孔，其上还带有离子通透所需的结合位点。S跨膜区上有一些碱性的氨基酸残基，它们以每隔两个氨基酸残基位置的规律进行排布，由于这些氨基酸残基上所带的正电荷形成电压传感器（voltage sensor），它们是通道对跨膜电势的变化进行反应所必需的结构。KAT1及AKT1与动物细胞上的去极化激活的K out通道结构类似，但通过KAT1和AKT1在爪蟾卵母细胞（Schachtman et al.1992）和酵母细胞中的（Bertl et al.1994）表达研究，及细胞电压钳位试验研究，发现这两个通道蛋白均为K in通道。,9.3高等植物K吸收转运基因及表达,高等植物K吸收转运也有高亲和与低亲和两种系统。目前已从拟南芥中克隆Kin通道（Cao et al.1995,Muller et al.1995）与Kout通道基因(Czempinski et al.1997)；从马铃薯中克隆了Kin通道基因(Ketchum and Slayman 1996)。,拟南芥的Kout通道KCO1已在昆虫细胞中得到表达(Czempinski et al.1997) ，这种通道对细胞中游离Ca浓度具有很大的依赖性，属于一类新的通道，被称为“两孔”通道(“two-pore ”channel)的成员(Ketchum et al.1995,Kochian 1993)。从小麦根尖已分离到K高亲和吸收转运体基因hkt1。,一、 拟南芥Kin通道基因KAT1 用拟南芥cDNA文库转化酵母双缺失突变体 (trk1trk2) ，发现了使突变体恢复在有限的K介质中生长的克隆KAT1（Anderson et al.1992）。KAT1阅读框有2031个核苷酸，编码677个氨基酸，分子质量78kDa。水合性作图分析的（hydropathy plot）推测该蛋白可能有7个跨膜结构，其中有6个结构成串排列在多肽的N端，这一结构是所有电压敏感Shaker家族K通道的结构特征。,比较KAT1与Shaker族的K通道的氨基酸序列，发现其同源性低于20，但6个跨膜区同源性较高。特别是在高度保守区具有相同的氨基酸。如电压敏感区（S4）及形成通道孔的区域（H5）。S4区位于第三（S3）和第五（S5）跨膜区之间。其序列中每隔34个氨基酸存在一个疏水性的赖氨酸或精氨酸等碱性氨基酸。,KAT1的162180位的氨基酸序列组成S4区，与Shaker族的K通道的相应区段氨基酸序列相比，变化主要在第168和176位氨基酸分别为丝氨酸。位于S5和S6区之间的H5区，与其他动物K通道同源性很高，尤其是第259和260个氨基酸为苏氨酸。苏氨酸被认为在离子选择吸收方面起重要作用（Yellen et al.1991;Yool et al .1991）。,KAT1通道对一价阳离子的传导率,KAT1转化到酵母细胞的表达特性出表明，KAT1是一种内流通道蛋白。对酵母野生型株系Y588、双缺失突变体trk1trk2 CY152CY162、pRS316载体转化的双缺失突变体CY162/pRS316及KAT1转化的双缺失突变体CY162p KAT1四类细胞进行全细胞模式电压钳位试验，发现双缺失株系突变体在任何电压条件下没有内流电流发生，野生型细胞有较小内流电流发生（在-200mV时仅为-50pA），而转化细胞发现有一个大的缓慢激活的内流电流产生，pRS316载体转化的双缺失突变体CY162pRS31没有内流电流发生。将KAT1转化体及载体转化体的电压钳位试验结果绘制电流电压曲线，同时将细胞外150 mmol/LKCl取代成10 mmol/LKCl及200 mmol/L山梨醇，发现有kat1的细胞内流电流的大小依赖于细胞外的K浓度。,用NH4或Na取代细胞外的K,研究KAT1转化的酵母细胞中KAT1通道的阳离子选择性吸收发现，150 mmol/L NH4或Na取代介质中150 mmol/LKCl后，内流电流分别下降15和5，KNH4， KNa渗透率分别为8和20左右。,3将KAT15启动子与GUS基因融合（KAT1：GUS）转移到拟南芥中。在所有11个转基因植株中，GUS基因表达活性最高的是下胚轴、子叶及712天幼苗的保卫细胞中，在只转入载体的植物中，没有发现GUS表达活性（Nakamura et al.1995）。,在11个转基因植物系中有2个系。发现GUS在根的维管组织有表达，但在根中的表达比在气孔部位的表达弱，这可能是气孔过多的GUS表达物转运到根，并在根中积累，或者GUS在根中有弱表达。KAT1主要在植物的保卫细胞中表达可能与KAT1通道与气孔的运动有关。,三、拟南芥K通道基因AKT2的结构及表达,将AKT1 cDNA克隆AccI酶切的1.6kb片段,及其KAT1的PCR片段(这些片段包括了6个跨膜片段)进行32P dATP标记，在低强度条件下，筛选拟南芥的cDNA文库，从5104噬菌体克隆中，筛选到3个阳性克隆。序列分析发现由两个分别为KAT1和AKT1，另外有一个新克隆，命名为AKT2。 AKT2基因的发现，证明了植物K+通道像动物K通道一样，也是以基因家族存在的,是植物产生不同K+通道的机制，也反映了植物的多种适应性。,Cao等人(1995)研究拟南芥AKT2的cDNA序列及其氨基酸序列发现，AKT2基因编码由802个氨基酸残基组成的蛋白质，分子质量为91.3kDa，亲水性分析推测AKT2多肽序列有6个可能的跨膜结构，分别为S1，S2，S3，S4，S5，S6和一个H5区，包含有6个糖基化位点和15个磷酸化位点。氨基酸的糖基化位点和磷酸化位点是跨膜蛋白的特有特征。AKT2蛋白的第415至498个氨基酸其他许多蛋白的环核苷酸结合区域同源，如与蝗虫EAG通道，环核苷酸门控通道及大肠杆菌降解物基因激活通道具有同源性。,在AKT2蛋白的环腺苷酸结合区域的下游有5个3233个氨基酸的重复序列，每一重复都有锚蛋白重复的特点，因为在锚蛋白及包含有锚蛋白重复的蛋白中，都有一个以33个氨基酸为一个单元的结构多次重复出现。锚蛋白重复结构可能通过与细胞