共焦拉曼光谱-郑晨.ppt

单个活态细胞的显微激光共焦拉曼光谱扫描技术应用研究,光学工程 郑晨 6121201006,目录,1、关于单个活态细胞的激光共焦拉曼光谱扫描技术的简介 2、显微共焦拉曼散射扫描技术 3、显微激光共焦拉曼散射光谱仪扫描参数优化和谱线处理技术研究 4、红细胞拉曼光谱研究 5、总结与展望,1、关于单个活态细胞的激光共焦拉曼光谱扫描技术的简介,1、生命科学是当今发展最为迅猛的一个领域,世界各国都在利用各种可能的手段和技术探索生命的奥秘。激光共焦拉曼散射光谱技术正是进行生物医学工程方面研究的有力工具之一。 2、拉曼光谱在70-80年代得到了高速发展,在生物、医学领域也进行了众多研究和应用。但是由于其信号较弱等缺点,对于非共振类型的样品,则存在应用局限。 3、1990年Pupples等人针对原有拉曼散射截面小等缺点,为了提高拉曼信号强度发展出高灵敏度共焦拉曼光谱仪,使之对不具有共振特点的样品的拉曼光谱也具有很好的探测能力。,Wood获得的随时间变化的红细胞拉曼图像和拉曼光谱。,2、显微共焦拉曼散射扫描技术,2.1拉曼散射概念,当电矢量为E的单色光入射到样品,样品的分子或原子的正负电荷分布发生变化形成电偶极距。该电偶极子的振动可辐射电磁波,发出散射光。 入射光与被照样品分子的作用不但可产生频率不变，强度很强的弹性散射一瑞利散射;还会产生频率发生变化的非弹性散射一拉曼散射。 拉曼散射有stokes散射和反stokes散射。 拉曼散射是光子与分子碰撞过程中,分子的振动和转动能量传递给光子,从而使光子的频率发生变化所产生的。,a图：分子光散射的几种成分：入射光（左下角）作用于分子产生了瑞利散射光（右上角）和拉曼散射光（右下角） b图：拉曼散射跃迁示意图,2.2 拉曼散射测量参数,1、拉曼散射的频率,或拉曼位移。拉曼位移的常用单位为波数。实际应用中常用 其Stokes散射谱。拉曼位移只与振动与转动能级有关,拉曼位移可反映物质本身内在的分子结构的信息。 2、强度I,即样品拉曼散射信号强度，处于共振态的谱带会显著增强。拉曼散射信号强度与入射光频率和极化率张量的变化有关。 3、去偏振度，也称为退偏比,它可表示散射物体各向异性的程度。 因此,进行拉曼光谱测量时通过测定样品的拉曼散射波谱和强度,可以获得样品分子伸缩振动和弯曲振动模式的信息,从而实现对被测样品的分子结构以及含量作出判断。,2.3 拉曼散射的优缺点,1、优点： （1）、拉曼光谱测定无须借助任何标记物 （2）、拉曼散射光谱技术可对溶液、气体、固体、薄膜、晶体等各种形式的物体进行实验 （3）、拉曼光谱可在很短的时间内快速获得(小于1s) （4）、拉曼光谱技术单次扫描的覆盖波数范围比红外吸收技术的覆盖区域大 2、缺点： （1）、最主要的缺点是拉曼散射信号较弱,故对样品的浓度要求高。 （2）、在采用波长较短激光做激发光时,容易引发样品荧光,从而常使拉曼光谱受到荧光的干扰,在使用中须尽量避免或滤除荧光的干扰,2.4、共焦技术的引入,上世纪90年代Pepple提出了共焦技术。共焦技术使得只有焦平面的信号可通过信号通道进入接收系统,而焦平面上或下的信号则被共焦孔阻挡,样品照明光阑针孔和光电检测光阑针孔互为共扼形成了共聚焦显微光路。 共焦显微镜利用共焦技术可对更精细位置的物质进行探测,可以进行单细胞水平的细胞内不同区域的探测 利用共焦技术可对样品内特定的小区域进行扫描,可利用共焦技术可实现点扫描!线扫描!二维扫描和三维扫描,2.4.1共聚焦扫描显微镜的原理,2.4.2二维扫描技术（拉曼成像）,二维扫描拉曼光谱技术是利用亮场像选取要成像的二维区域,并设置两个方向的扫描范围及相邻两个扫描点的间隔，得到各个点的拉曼光谱后,再根据感兴趣的谱线或谱型特点,对特定分子的二维分布成像。也可以同时对几种感兴趣分子或分子结构在二维空间的分布成像。 如果配备了二维CCD探测系统和相应的位置控制系统,可以进行快速的二维扫描,逐点扫描的二维拉曼光谱扫描技术,3、显微激光共焦拉曼散射光谱仪扫描参数优化和谱线处理技术研究,进行拉曼光谱测量时通过测定样品的拉曼散射谱频移和强度,可以获得样品分子伸缩振动弯曲振动模式的信息,从而实现对被测样品的分子结构以及含量作出判断 扫描参数优化的意义是以较短的时间、较少的样品、近乎无扰的状态获得高品质的拉曼谱线。而针对不同的细胞样品与不同的实验目标需设立对应合适的扫描测定以及光谱处理分析技术,3.1 方法,对活态细胞产生影响的主要因素是激光功率密度的大小、激光照射时间的长短等，因此在进行参数优化前,一些参数可以提前进行预设 对于点扫描模式,在物镜、共焦孔径等参数确定下来后,主要的变量参数为照射到样品的激光功率密度 对于线扫描和二维扫描模式,除了激光功率密度外,还要考虑扫描的 步进距离(扫描点间隔)或其他因素,线扫描模式下,红细胞在不同样品照射激光功率和扫描步进设置下扫描前(左)后(右)亮场像比较,4.红细胞拉曼光谱研究,4.1、红细胞的特点,红细胞是体内最重要的细胞之一,它的主要生理功能是携氧功能,为体内的组织和器官输送氧气并带走二氧化碳,而且对维持体内平衡态起重要作用 正常成熟的红细胞呈双凹圆盘状成熟人红细胞无核,主要由细胞膜和细胞内占95%的血红蛋白组成,4.2 514nm激发光下活态红细胞拉曼光谱,所用设备为HoribaJY公司生产的倒置显微激光共焦拉曼光谱系统配置的激光器为Ar+离子激光器,其激发波长为514.5nm。该系统使用奥林巴斯倒置显微镜,实验使用60倍物镜 激光焦点处光斑直径约2um,狭缝设置为100um，共焦孔径设置为200um。实验采集的波谱范围为600一1800/cm,谱分辨率约1/cm,曝光积分时间1s。开机后利用硅片位于520.7/cm的谱带进行日常系统校正 将得到的拉曼谱线进行特征峰的比较,然后对谱线进行宇宙射线消除、分类、平均和平滑等一系列处理得到每个样品的谱线。此种处理得到的谱线不仅信噪比好,而且具有很好的指纹特性,对于处于T态的红细胞拉曼光谱,其特征是没有位于1638/cm(v10)的谱线,而位于1358/cm和1606/cm附近的谱线强度很高。而对处于R态的红细胞的拉曼光谱,位于1638/cm,和1370一1374/cm附近的谱线强度很强,处于1606/cm的谱线强度有所下降,位于1358/cm,的谱线甚至消失。位于T态和R态之间的血红蛋白中间态有四个子类,分别是M1、M2、M3和M4,v4的谱带出现的位置具有多样性、复杂性。血红蛋白拉曼光谱的v4谱线出现位置的移动和谱带展宽。,血红蛋白拉曼光谱的v4谱线出现多峰情形,4.3 讨论,活态红细胞可展现出非常丰富的拉曼光谱，本研究显示活态红细胞拉曼光谱不仅有属于典型T态或R态的谱线,还有很多类型的谱线既不同于T态谱线,也不同于R态谱线 考虑到血红蛋白构象变化的复杂性和拉曼光谱的敏感性,本研究认为应将血红蛋白拉曼光谱根据其谱型特点进行更为详细的分类，即对T态到R态的中间过渡过程的谱线进行分析并分类，如果不按照谱线的特点进行分类,生物样品的一些关键信息可能会被掩盖。例如红细胞在514nm激发光下的拉曼光谱v4,变化的丰富性就不会显现出来。,5.总结与展望,1、为得到准确、精细的拉曼光谱,为了提高样品间拉曼光谱的可比性,需要对系统的性能参数进行快速测试和校正；;校正、测试的参数应包括波数精度的校正、系统稳定性测试、照射到样品的激光功率(功率密度)、扫描运动精度校正、共焦性能、焦点位置、光斑尺寸； 2、对谱线进行分类再平均的处理可更好地表现活态细胞丰富的指纹谱,尤其是当样品有非常敏感但强度较弱的谱线时更突出;利用此方法获得了对红细胞拉曼光谱的详细分类(T1、M1、M2、M3、M4和R态),谢谢,