《色谱测定法》PPT课件.ppt

色谱测定法,生物药物分析测定方法,色谱测定法,色谱法根据其分离原理可分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与排阻色谱法等。 吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱使组分分离；常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。,分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分离，其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相，另一相为液体或气体，称为流动相；常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。,离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换剂（树脂、凝胶）上交换能力的不同使组分分离；常用的交换剂有不同强度的阳离子交换剂、阴离子交换剂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。,分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。,色谱法又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。所用溶剂应与供试品不起化学反应，纯度要求较高。分析时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温操作。分离后各成分的检出，应采用各品种项下所规定的方法。,纸色谱法 纸色谱法系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置(比移值=原点中心至斑点中心的距离原点中心至展开剂前沿的距离)。但由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。,作为药品的鉴别时，供试品在色谱图中所显主斑点的位置与颜色(或荧光)，应与对照品在色谱图中所显主斑点相同。 作为药品的纯度检查时，可取一定量的供试品，经展开后，按各品种项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色深度(或荧光强度)。 作为药品的含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定。,1仪器与材料 (1) 展开容器通常为圆形或长方形玻璃 缸，缸上具有磨口玻璃盖，应能密闭。 用于下行法时，盖上有孔，可插入分液 漏斗，用以加入展开剂。在近顶端有一用 支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器，槽 内有一玻棒用以压佳色谱滤纸；槽的两 侧各支一玻棒，用以支持色谱滤纸使其自 然下垂，避免展开剂沿色谱滤纸与溶剂槽 之间发生虹吸现象。,用于上行法时，在盖上的孔中加塞，塞中插入玻璃悬钩，以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上；并除去溶剂槽和支架。 (2) 点样器 常用具支架的微量注射器或定量毛细管，应能使点样位置正确、集中。,(3) 色谱滤纸应质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂质；也不应与所用显色剂起作用，以致影响分离和鉴别效果，必要时可进行处理后再用。用于下行法时，取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，离纸条上端适当的距离用铅笔划一点样基线，必要时，可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。用于上行法时，色谱滤纸长约25cm，宽度则按需要而定，必要时可将色谱滤纸卷成筒形；点样基线距底边约2. 5cm。,2操作方法 (1) 下行法将供试品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，样点直径为24mm，点间距离约为1.52.0cm，样点通常应为圆形。,将点样后的色谱滤纸的点样端放在溶剂槽内并用玻棒压住，使色谱滤纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。展开前，展开缸内用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和，一般可在展开缸底部放一装有规定溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开缸内壁上，放置一定时间，俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。,然后添加展开剂使浸没溶剂槽内的色谱滤纸，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出色谱滤纸，标明展开剂前沿位置，俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。,(2)上行法点样方法同下行法。展开缸内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。 展开可以单向展开，即向一个方向进行；也可进行双向展开，即先向一个方向展开，取出，俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90，再用原展开剂或另一种展开剂进行展开；亦可多次展开、连续展开或径向展开等。,高效液相色谱法系采用高压输液泵将规 定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行 分离测定的色谱方法。注入的供试品，由 流动相带入柱内，各成分在柱内被分离， 并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或 数据处理系统记录色谱信号。 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样 系统、分离系统、检测系统、记录系统等 五大部分组成。,高效液相色谱法,分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开 泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线 平直后，用微量注射器把样品注入进样口， 流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后 的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗 脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分 流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电 信号，经过放大，用记录器记录下来就得到 色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高 低的依据。,1对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。 (1) 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。 反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷镑合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等)也有使用。,正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂斥于对映异构体的拆分分析。,填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在15nm以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选孔径在30nm以上的填料。,(2)检测器 最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器(DAD)、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。,(3)流动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。,各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。,2.系统适用性试验 色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。,(1)色谱柱的理论板数(n) 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh/2)，按 n = 5.54(tRWh/2)2 计算色谱柱的理论板数。,Wh/2,tR,(2)分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为：,2(tR2 - tR1) R = W1 + W2,式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tRl为相邻两峰中前一峰的保留时间； w1及w2为此相邻两峰的峰宽(如下图)。,除另有规定外，定量分析时分离度应大于1.5。,(3)重复性 各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80、100和120的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0。,(4)拖尾因子(T) 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：,式中 W0.05h为5峰高处的峰宽；dl为峰顶点至峰前沿之间的距离(如下图)。,W0.05h T = 2d1,除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之间。峰面积法测定时，T值偏离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。,3测定法 (1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量 按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：,式中：As为内标物质的峰面积或峰高； AR为对照品的峰面积或峰高； cs为内标物质的浓度； cR为对照品的浓度。,As/cs T校正因子(f) = AR/cR,再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分(或其杂质)和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：,Ax 含量(cx) = f As/cs,式中：Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高； cx为供试品(或其杂质)的浓度； As为内标物质的峰面积或峰高； cs为内标物质的浓度；f为校正因子。,(5)面积归一化法 由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。 方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面乖及其之和占总峰面积的百分率。,分子排阻色谱法,分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同大小的孔径。,药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。,1对仪器的一般要求 分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一般分常压、中压和高压。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH值不宜超出填充剂的耐受力，一般pH值在28范围。流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30，流速不宜过快。一般每分钟为0.51.0ml。,2系统适用性试验 高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：,二聚体的峰高,单体与二聚体之间的谷高,R =,除另有规定外，分离度应大于2.0。,(1)分子量测定法 一般适用于蛋白质多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠(SDS)处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量(MW)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程 lgMw = a + btR，供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。,(2)高分子杂质测定法 高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在生产或贮存过程由产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏反应的高分子物质。,按各品种项下规定的色谱条件进行分离。 定量方法 主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规：一般用于高分子杂质含量较低的品种。 面积归一化法同高效液相色谱法项下规定。 限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分，一般用于混合物中高分子物质的控制。,检测标准：用280nm波长检测，应呈一个吸收峰，或主峰应不低于总面积的95%。 色谱柱：TSK G 2000SWxL 7.8300mm 流动相：PBS (20mM pH=7.0) 脱气、0.45m滤膜过滤。 色谱条件： PBS流速：0.5 ml/min；柱温： 室温 ； 检测波长：280nm。 样品分析：取供试品溶液进样5l，记录色谱图，得出积分面积，纯度应大于95%。,HPLC应用实例 1、干扰素HPLC纯度测定,取本品3支,每支加注射用水适量溶解使浓度约为1mg/ml，充分混合后标准品及供试品按下法各进样2次，重复进样峰面积相对偏差应小于2.5%。求得平均含量，应符合规定；若不符合规定，另取6支复试，应符合规定。含量应为标示量的90.0-110.0%，高分子含量应不超过6.0%。,2、生长激素含量及高分子蛋白测定,1. 仪器 1.1 HPLC装置 1.2 色谱柱 ：TSK G2000SWxL 7.5300mm 2. 溶液的配制：0.395%W/V碳酸氢铵， 脱 气、0.45m滤膜过滤。 3. 标准溶液配制：用标准品(中检所购买) 一支，0.395%W/V碳酸氢铵配成1mg/ml。,4. 样品分析 4.1 色谱条件 流动相：0.395%W/V碳酸氢铵 流速：0.6 ml/min 柱温：室温 检测波长：214nm 进样量：20l 4.2 计算：,取标准溶液和供试品溶液各20l进样，记录色谱图，测量标准品和供试品所测成分的峰面积，计算。 供试品峰面积 标准品浓度稀释倍数 样品含量百分比 = 100% 标准品峰面积 样品标示含量, 高分子蛋白峰面积 高分子蛋白含量 = 100% 总峰面积,检测标准：总相关蛋白峰面积不超过总峰面积的13.0%。检验操作如下： 1.仪器：HPLC装置 色谱柱C4 2.试剂的配制： 2.1 Tris缓冲液(0.05mol/L pH7.5):Tris 6.05g，加水800ml溶解，浓盐酸调pH至7.5后定容至1000ml。 2.2 流动相： A液：Tris缓冲液(0.05mol/L pH7.5)，经0.22m膜过滤、脱气； B液：正丙醇（色谱纯），脱气。,3、生长激素相关蛋白测定,2.3 洗柱液：正丙醇200ml，加水至 500ml，混匀脱气。 3. 标准溶液准备 3.1系统适应性标准溶液：重组人生长激 素标准品以Tris缓冲液配成 2.0mg/ml 溶液，为溶液1，取溶液1加入新鲜过氧化 氢(30%)使其最终浓度为0.01%(v/v)， 4 放置5小时后，每毫升加4.5mg L-甲硫氨 酸，即得。,3.2 对照品溶液： 取溶液1，以Tris缓冲液稀释成1.0mg/ml的溶液作为鉴别用对照品溶液。上述两种溶液在2-8稳定24小时。 4.供试品溶液的准备： 取供试品，以Tris缓冲液稀释成1mg/ml。,5 样品分析 5.1 色谱条件： 色谱柱：C4柱,25cm4.6cm. 进样量：20l 流速：0.5ml/min 检测波长：220nm 柱温：45 流动相：0.05mol/LTris:正丙醇=71:29,5.2 系统适应性试验： 进系统适应性溶 液，调节流动相中正丙醇的比例，确定合 适的主峰保留时间，分离度R应大于1.0。 5.3.相关蛋白含量 , 相关蛋白峰面积 相关蛋白含量 = 100% 总峰面积,