何水林版基因工程第四章基因操作过程教学版

第四章基因操作过程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程转化子的筛选和鉴定（检）重组DNA分子的转化和扩增（转、增）DNA的体外重组（切、接）基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程第一节第一节DNA的体外重组的体外重组DNA的体外重组的体外重组：将目的将目的DNA、载体载体DNA在在DNA连接酶的作用连接酶的作用下，在体外进行分子连接（重下，在体外进行分子连接（重组）过程组）过程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程亚克隆亚克隆：把把DNA片段从片段从某一类型的载体无性克某一类型的载体无性克隆繁殖支另一类型的载隆繁殖支另一类型的载体的过程。体的过程。基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程理想的酶切位点应当符合下列几个条件理想的酶切位点应当符合下列几个条件位于载体上的酶切位点要尽可能少，最好是单一的位于载体上的酶切位点要尽可能少，最好是单一的酶切位点酶切位点酶切位点前方要一个较强的启动子酶切位点前方要一个较强的启动子选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过程选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不改变中的编码区读框不改变基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程 外源外源DNA与载体的连接方法与载体的连接方法黏性末端连接法黏性末端连接法平未端连接法平未端连接法人工接头连接法人工接头连接法同聚物加尾连接法同聚物加尾连接法基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程1黏性末端连接法黏性末端连接法单酶切位点黏性单酶切位点黏性末端连接法末端连接法基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程单酶切位点黏性末端单酶切位点黏性末端连接法的缺点连接法的缺点自身环化自身环化双向插入双向插入多拷贝插入多拷贝插入假阳性假阳性基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程双酶切片段的定向克隆双酶切片段的定向克隆外源外源DNA和载体和载体DNA经过两个限制性内切酶切经过两个限制性内切酶切割后为非同源互补的黏性末端连接割后为非同源互补的黏性末端连接外源外源DNA和载体和载体DNA经过两个限制性内切酶切经过两个限制性内切酶切割后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端割后一侧产生的黏性末端，另一侧产生平未端（可先生成黏性末端再补平）（可先生成黏性末端再补平）基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程双酶切片段的定向克隆的优点双酶切片段的定向克隆的优点外源外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中，以便目的基因只能以一个方向定向插入到重组质粒中，以便目的基因的正确转录和表达的正确转录和表达载体与外源载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留，可以随时从重结合处的限制酶切位点仍然保留，可以随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离获得目的基因组载体中通过相应的限制性内切酶切割后分离获得目的基因不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大多数携带有目的基因的重组质粒基因的重组质粒基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接2平末端的连接平末端的连接基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程从分子从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaCl），），最终浓度最终浓度150-200 mM基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程平末端的连接的优点平末端的连接的优点适用于外源适用于外源DNA片段与载体只有一个匹配点，同时考虑靶基片段与载体只有一个匹配点，同时考虑靶基因插入方向时使用因插入方向时使用靶基因以一个方向插入且非重组克隆背景低靶基因以一个方向插入且非重组克隆背景低可用可用T4DNAligase连接任何平末端连接任何平末端基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程3人工接头连接法人工接头连接法人工接头人工接头又称衔接物、适配子，是人工又称衔接物、适配子，是人工合成的具有一个或多个限制性合成的具有一个或多个限制性内切酶识别和切割序列的双平内切酶识别和切割序列的双平端端DNA短序列，其分子长度约短序列，其分子长度约为为812bp。基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程粘性末端的更换粘性末端的更换基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程4同聚物加尾同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接法连接法同聚物加尾连接：同聚物加尾连接：利用末端转移酶在载体及外源双链利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的的3端各端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体和载体DNA分分子要分别加上不同的寡聚核苷酸子要分别加上不同的寡聚核苷酸dA(dG)和和dT(dC),然后在然后在DNA连接酶的作用下连接酶的作用下,连接成为重组的连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的这种方法可适用于任何来源的DNA片段。片段。但方法较繁，需要但方法较繁，需要核酸外切酶、核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用核酶、末端转移酶等协同作用 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 5突出末端突出末端基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 3突出末端突出末端基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接 平头末端平头末端基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法主要优点主要优点不易自身环化不易自身环化连接效率较高连接效率较高同一种同一种DNADNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化载体和外源片段的末端是互补的粘性末端载体和外源片段的末端是互补的粘性末端是一种通用的体外重组的方法是一种通用的体外重组的方法用任何一种方法制备的用任何一种方法制备的DNADNA都可以用这种方法进行连接都可以用这种方法进行连接基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程5重组率重组率重组率的定义重组率的定义重组率重组率 =含有外源含有外源DNA的重组分子数的重组分子数 /载体分子总数载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化大大简化DNA重组的后续操作。重组的后续操作。基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程提高重组率的方法提高重组率的方法提高外源提高外源DNA片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5:1-10:1 载体载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团：基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程提高重组率的方法提高重组率的方法加装同聚尾末端：加装同聚尾末端：基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程第二节重组体导入第二节重组体导入转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程1 用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程1.1受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重组整合缺陷型重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程1.2各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性大肠杆菌大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定重组子稳定适用于外源适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素产结构复杂、种类繁多的内毒素基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程枯草杆菌枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简，生长迅速，培养简单，不产内毒素单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备遗传欠稳定，载体受体系统欠完备基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程链霉菌链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢遗传不稳定，生长相对缓慢基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程酵母菌酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验重组实验和基因工程重要的真核性受体菌和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高内源性蛋白产物种类繁多且含量高基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达适用于真核生物基因的高效表达DNA重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞 CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统具有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢细胞培养条件苛刻，生长缓慢 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程植物细胞（拟南芥、烟叶植物细胞（拟南芥、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用养简单且成本低廉，具有光合作用遗传操作繁琐遗传操作繁琐 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程拟南芥（拟南芥（Arabidopsis thaliana）总状花序总状花序顶生顶生花瓣花瓣4片，片，白色，匙形白色，匙形十字花科，二年生草本，十字花科，二年生草本，高高740cm，植株小、，植株小、每代时间短、结子多、每代时间短、结子多、生活力强生活力强基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程拟南芥是进行遗传学研究的好材料拟南芥是进行遗传学研究的好材料被科学家誉为被科学家誉为“植物中的果蝇植物中的果蝇”拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的每个单倍染色体组（每个单倍染色体组（n=5）的总长只有）的总长只有7000万万bp拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程1.3实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体大肠杆菌大肠杆菌用于接受质粒：用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受用于接受l l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌酵母菌哺乳动物细胞哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母（毕赤酵母（Pichia pastoris）啤酒酵母啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程克隆与导入方法：克隆与导入方法：转化：转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体菌细胞遗传性状发生改变将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体菌细胞遗传性状发生改变转染：转染：携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法电转化：电转化：受体细胞施加短暂的高压电流，其质膜上形成微孔，外源受体细胞施加短暂的高压电流，其质膜上形成微孔，外源DNA通过微孔进入宿主细胞通过微孔进入宿主细胞基因枪法：基因枪法：利用压缩气体动力，产生的冷气体冲击波进入轰击室，把粘利用压缩气体动力，产生的冷气体冲击波进入轰击室，把粘有有DNA的金粉打向细胞核。的金粉打向细胞核。微注射法：微注射法：将外源基因直接注射到真核受体细胞内转化酵母菌将外源基因直接注射到真核受体细胞内转化酵母菌植物细胞的植物细胞的叶盘法基因转移叶盘法基因转移2重组重组DNA导入受体细胞的方法导入受体细胞的方法基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程2.1转化（转化（transformation）感受态的大肠杆菌捕获和表达质粒载体感受态的大肠杆菌捕获和表达质粒载体DNADNA分子的生命过程分子的生命过程 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如E.coli等）等）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化1970年建立此技术，原理是年建立此技术，原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，晶结构，经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细细菌细胞处于容易吸收外源胞处于容易吸收外源DNA的状态叫做的状态叫做感受态感受态(competent)转化子（转化子（transforment）：导入外源导入外源DNADNA后获得了新的遗传后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。标志的细菌细胞或其它受体细胞。基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程pUC18质粒质粒 实验试剂实验试剂大肠杆菌大肠杆菌DH5LB培养基培养基0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）溶液（预冷）氨苄青霉素氨苄青霉素基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程用接种环直接取冻存的大肠杆菌用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在，在LB培养培养基平板表面划线，于基平板表面划线，于37培养培养16小时小时 实验步骤实验步骤菌株活化菌株活化基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程挑取一个单菌落，转到挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于培养基中，于37培养培养35小时小时 将培养液全部转到将培养液全部转到100mlLB培养基中培养培养基中培养23小时，到小时，到OD6000.30.4 1个个OD600约含约含E.coli109个个/mL 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程加入加入0.2ml预冷的预冷的0.1mol/l CaCl2，悬浮沉淀，即可使用。，悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积也可加入总体积15的甘油的甘油 可可70长期保存长期保存 感受态细胞制备感受态细胞制备:将培养液转入将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置离心管中，在冰上放置1530min44000rpm离心离心5min，弃上清，弃上清加入加入0.8ml预冷的预冷的0.1mol/L CaCl2，悬浮，悬浮沉淀，冰上预冷沉淀，冰上预冷10min4000rpm离心离心5 min，弃上清，弃上清基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程外源外源DNA的转化的转化取目的取目的DNA加入大肠杆菌感受态细加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置胞中，于冰上放置30min42水浴水浴90S（切勿摇晃！）（切勿摇晃！）冰上放置冰上放置2min加入加入800l LB液体培养基液体培养基37水浴复苏水浴复苏50 min基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程37培养培养916h铺铺200l于含于含X-gal，IPTG，Amp的的LB平板平板（含（含100g/mL Amp，表面均匀涂有，表面均匀涂有16L 50mg/mL的的X-gal和和4L 200mg/mL的的IPTG混合液）混合液）基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程利用成品感受态细菌转化利用成品感受态细菌转化基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程在在Selektionsplatten(LB/Amp/IPTG/X-Gal)上生长的是转化子上生长的是转化子非重组子非重组子重组子重组子基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程同时做两个对照同时做两个对照:以同体积的无菌双蒸水代替重组质粒以同体积的无菌双蒸水代替重组质粒DNADNA溶液溶液,其它操作与上面其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的相同。此组正常情况下在含抗生素的LBLB平板上应没有菌落出现平板上应没有菌落出现阴性对照阴性对照感受态细胞被有抗生素抗性菌株污染，可长出菌落感受态细胞被有抗生素抗性菌株污染，可长出菌落 选择性平板失效，可长出菌落选择性平板失效，可长出菌落 选择性平板被有抗生素抗性菌株污染，可在平板边缘或选择性平板被有抗生素抗性菌株污染，可在平板边缘或中间长出菌落中间长出菌落 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程以同体积的无菌双蒸水代替以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液溶液,但涂板时只取但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下平板上，此组正常情况下应产生大量菌落应产生大量菌落阳性对照阳性对照基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程 电穿孔转化电穿孔转化 将待转化的质粒或将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程将细菌溶于将细菌溶于12ml 10%的甘油中，以的甘油中，以4080l/管分装管分装-70冻存，备用冻存，备用挑一个挑一个DH10B的单菌落接种于的单菌落接种于5ml 液体液体LB中，过夜培养中，过夜培养1/100 接种后接种后37，220转转/min，摇菌，摇菌2h(OD500达达0.7左右左右)6000rpm,4离心离心15min,收集菌体，以下均需在冰上操作收集菌体，以下均需在冰上操作用等体积的灭菌去离子水彻底洗细菌沉淀，离心收集用等体积的灭菌去离子水彻底洗细菌沉淀，离心收集用用1/2的灭菌去离子水彻底洗细菌沉淀，离心收集的灭菌去离子水彻底洗细菌沉淀，离心收集加入加入2030ml 10%的灭菌甘油洗细菌沉淀，离心收集的灭菌甘油洗细菌沉淀，离心收集基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程将脉冲电击转化仪打开，调电压为将脉冲电击转化仪打开，调电压为1.8KV从从-70取出保存的感受态细胞，解冻后置于冰上取出保存的感受态细胞，解冻后置于冰上每管感受态细胞加入每管感受态细胞加入1l 连接产物连接产物,转移到电击杯中转移到电击杯中电击，然后迅速向电击杯中加入电击，然后迅速向电击杯中加入1ml液体液体LB培养基培养基将电击后的菌液转移至将电击后的菌液转移至1.5ml Eppendorf管，管，37恒温摇床培养恒温摇床培养1h铺铺100l于含于含X-gal和和IPTG的的Amp平板平板37恒温培养箱培养恒温培养箱培养916h基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程2510电转仪，适用于原核细胞电转仪，适用于原核细胞适用于真核细胞电转适用于真核细胞电转化及原生质体融合化及原生质体融合基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程In vitro packaging and transfection2.2转染（转染（transfection）基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程l l噬菌体噬菌体DNA的转染的转染感受态细胞的培养：感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基的培养基 中培养至中培养至OD600=0.5吸附：吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，3030保温保温1010分钟分钟转染裂解：转染裂解：加入加入2020倍体积的新鲜培养基，倍体积的新鲜培养基，3030培养培养2 2小时，直至培养液小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程3转化率转化率转化率是衡量转化效率的重要指标转化率是衡量转化效率的重要指标转化率转化率：每微克载体：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程如：如：pUC18对大肠杆菌的转化率为对大肠杆菌的转化率为108，即每微克，即每微克pUC18中只有中只有108个分子能进入受体细胞。一微克个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有共有3.41011个分子个分子（6.021017/2686660），即每），即每3400个个pUC18分子才有一个分子分子才有一个分子进入受体细胞进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需共需2ml感感受态细胞，大约含有受态细胞，大约含有21010个大肠杆菌细胞，也就是说，每个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个个细胞只有一个细胞能接纳细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程转化率的用途转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模重组实验规模例如，例如，某一某一DNA重组实验的重组率为重组实验的重组率为20%，转化率为，转化率为107/m mg载体，载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，倍，欲获得欲获得10104个个 重组克隆，需投入多少载体重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？进行重组实验？若重组率为若重组率为100%，则转化后产生，则转化后产生104个重组克隆需要：个重组克隆需要：104/107 X 10-2=0.1 m mg 载体载体DNA 考虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：，所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.5 m mg 载体载体DNA 载体投入量确定后，外源载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按的投入量即可按10 1的要求算的要求算出出（5 m mg），），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程转化率的影响因素转化率的影响因素载体及载体及DNA重组分子方面：重组分子方面：载体本身的性质载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程受体细胞方面：受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；株，转化率很低；但对大肠杆菌但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高株的转化率则较高 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程转化方法方面：转化方法方面：受体细胞的预处理受体细胞的预处理：影响最大影响最大供受体的比例供受体的比例：Ca2+诱导转化诱导转化 0.1 ml 感受态感受态细胞细胞 50 ng DNA 转化方法转化方法：Ca2+诱导转化诱导转化 106-107/m mg DNA 原生质体转化原生质体转化 109 个个原生质体原生质体 50 ng DNA 原生质体转化原生质体转化 105-106/m mg DNA l l-DNA转染转染 107-108/m mg DNA 电穿孔转化电穿孔转化 106-109/m mg DNA 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程4转化细胞的扩增转化细胞的扩增扩增操作的目的扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程扩增操作扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的诱导转化后的37培养一个小时培养一个小时 原生质体转化后的再生过程原生质体转化后的再生过程 噬菌体转染后的噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作培养等，均属扩增操作 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程第三节重组子的筛选第三节重组子的筛选“选择选择”（selection）和）和“筛选筛选”（screening）的基本含）的基本含义义 选择：选择：是指通过某种外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现是指通过某种外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法分子的特定克隆类型的一种方法 筛选筛选：是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文：是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需要重组库中，鉴定出真正具有所需要重组DNA分子的特定克隆的过程分子的特定克隆的过程简单选择简单选择：根据克隆载体提供的表型特征的根据克隆载体提供的表型特征的选择选择直接选择：直接选择：根据突变的互补作用对克隆基因的选择根据突变的互补作用对克隆基因的选择基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分助各种筛选和鉴定方法区分转化子转化子与非转化子、与非转化子、重组子重组子与与非重组子、非重组子、目的重组子目的重组子与非目的重组子与非目的重组子物理检测法物理检测法 核酸杂交法核酸杂交法 免疫化学法免疫化学法遗传检测法遗传检测法重组子的筛选方法主要有重组子的筛选方法主要有DNA测序检测法测序检测法 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程1遗传检测法遗传检测法插入失活选择法插入失活选择法（Tetr等等)显色互补选择法（显色互补选择法（LacZ）抗药性标记抗药性标记(Ampr、Tetr等等)插入表达选择法插入表达选择法（C阻碍蛋白失活，阻碍蛋白失活，C 表达）表达）利用报告基因选择法（利用报告基因选择法（GUS、Gfp、NTP、LUC、TK等）等）1.1根据选择性标记筛选转化子根据选择性标记筛选转化子基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程抗药性筛选法抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法的基本原理：pBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分转化子与非抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子转化子、重组子与非重组子将外源将外源DNA片段插在片段插在EcoRI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈重组子呈 Apr、Tcr 将外源将外源DNA片段插在片段插在BamHI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈重组子呈 Apr、Tcs 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有先将转化液涂布含有Amp的平板的平板再将再将Amp平板上的转化子影印至平板上的转化子影印至含有含有Amp和和Tet的平板上的平板上 在在Ap平板上生长、但在平板上生长、但在Ap和和Tc平板上平板上不长的转化子即为不长的转化子即为 ApAp+Tc影印影印挑选挑选重组子重组子 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作：pUC18AprlacZoriAp+X-gal重组子（重组子（Apr+lacZ-）将外源基因克隆在将外源基因克隆在pUC18的的lacZ标标记记基因内部，使之灭活，此时重组子基因内部，使之灭活，此时重组子呈呈Apr、lacZ-，白色菌落白色菌落；而非重组；而非重组子则呈子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落蓝色菌落 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程1.2营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法可以区分营养缺陷型筛选法可以区分转化子转化子与非转化子，一般不能区与非转化子，一般不能区分分重组子重组子与非重组子。与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子养组份的培养基上，长出的便是转化子 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程常见的营养缺陷型筛选标记：常见的营养缺陷型筛选标记：哺乳动物细胞中存在两条哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：的合成途径：用于用于大肠杆菌大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于用于高等哺乳动物细胞高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因酶基因tk，相应的受体细胞则选择相应的受体细胞则选择tk-缺陷型缺陷型dCDPdTDPdTTPTRdTMPdTDPdTTPAPTKAP 氨基喋呤氨基喋呤TK 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程2依赖重组子结构特征的筛选法依赖重组子结构特征的筛选法凝胶电泳法凝胶电泳法带有插人片段的重组体在相对分子质量上会有所增加带有插人片段的重组体在相对分子质量上会有所增加分离质粒分离质粒DNADNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法并测定其分子长度是一种直截了当的方法通常用比较简单的凝胶电泳进行检测。通常用比较简单的凝胶电泳进行检测。但电泳法不能鉴别插入片段是大小相近的非目的基因片段但电泳法不能鉴别插入片段是大小相近的非目的基因片段基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法对载体上插入的外源对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比与目的基因的已知图谱对比因此利用这种方法不仅能区分因此利用这种方法不仅能区分重组子重组子与非重组子，而且还能与非重组子，而且还能鉴定鉴定目的重组子目的重组子但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本高实验成本高基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程3核酸杂交法核酸杂交法从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是核酸分子杂交技术法是核酸分子杂交技术分子杂交分子杂交(molecular hybridization)：利用带有标记（放射性同位素利用带有标记（放射性同位素(32P或或125I)、生物素或荧光酶等）探针（、生物素或荧光酶等）探针（DNA、RNA或蛋白质）进行相或蛋白质）进行相同或不同种类分子之间杂交同或不同种类分子之间杂交根据其检测对象的不同可分为根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、杂交、Northern 杂交杂交和和 Western 杂交杂交，以及由此而简化的，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交斑点杂交、狭线杂交和和菌落杂交菌落杂交等。等。基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程3.1探针及制备探针及制备 在分子杂交来检测中，一段带有标记的与目标核酸分在分子杂交来检测中，一段带有标记的与目标核酸分子序列同源的互补核酸片段称为子序列同源的互补核酸片段称为探针探针（probe）探针的类型探针的类型 寡核苷酸探针寡核苷酸探针基因组基因组DNA探针探针cDNA探针探针RNA探针探针单链单链DNA探针探针基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程寡核苷酸探针（寡核苷酸探针（oligonucleotid probe）：是人工合成且被适当标记的是人工合成且被适当标记的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的由短链核苷酸组成的大分子（即一段比较短的DNA或或RNA），能与），能与被检测长链被检测长链DNA或或RNA进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标进行分子杂交，且杂交后可由该分了上的标记显示目的长链记显示目的长链DNA或或RNA分子的存在。分子的存在。常用寡核苷酸探针的标记物常用寡核苷酸探针的标记物放射性同位素标记：放射性同位素标记：32P、33P、35S非放射性标记：非放射性标记：生物素、地高辛生物素、地高辛生物素生物素dUTP、生物素、生物素dATP、地高辛、地高辛dUTP等等基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程杂交探针的标记：杂交探针的标记：ABC荧光标记荧光标记基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程杂交探针的标记：杂交探针的标记：ABC显色酶标记显色酶标记基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程地高辛地高辛dUTP杂交探针的标记：杂交探针的标记：地高辛系统标记地高辛系统标记基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程两种地高辛两种地高辛dUTP显色系统显色系统基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程DIGDIG探针杂交过程探针杂交过程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程杂交探针的制备：杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链单链结构（双链DNA可用碱变性）可用碱变性）足够长度（至少足够长度（至少12个个碱基）碱基）内部不含互补区内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：探针的制备方法或来源包括：人工合成人工合成 cDNA合成合成 同源序列同源序列 mRNA GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGC A基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程T4-PNP介导的末端标记介导的末端标记探针的标记方法探针的标记方法切口移位切口移位(平移平移)法法引物延伸法引物延伸法末端标记法末端标记法体外转录或反录法体外转录或反录法末端标记末端标记TdT介导的末端标记介导的末端标记T4-Pol介导的末端标记介导的末端标记基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程DNA聚合酶聚合酶介导的介导的切口平移切口平移标记标记基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程DNA聚合酶聚合酶介导的介导的随机引物法随机引物法基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程逆转录酶逆转录酶介导的介导的反转录标记反转录标记3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5mRNA反转录酶反转录酶Mg2+dNTP+pppdATP（a a-32P-dATP）5TTTTTTTTTTT5mRNA3cDNA3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT5TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程转转录录酶酶介介导导的的转转录录标标记记基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程3.2原位杂交原位杂交(insitu hybridization)菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑菌落或噬菌斑杂交，将生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用变性和杂交作用基本程序是：将被筛选的基本程序是：将被筛选的大肠杆菌菌落或噬菌斑大肠杆菌菌落或噬菌斑，从其生长的琼，从其生长的琼脂平板中脂平板中转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维素滤膜上，进行适当的上，进行适当的温育温育，保藏原来，保藏原来的菌落平板作为参照，以便从中的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆挑取阳性克隆。基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程复制平板和膜转复制平板和膜转印时应在平板和印时应在平板和膜上的一侧做三膜上的一侧做三个对应的标签个对应的标签0.5MNaOH裂解细菌裂解细菌酸中和酸中和蛋白酶处理蛋白酶处理漂洗细胞碎片漂洗细胞碎片80烘烤烘烤与与32P-标记的标记的探针杂探针杂交交放射性放射性自显影自显影在参照平板上挑在参照平板上挑取目标阳性克隆取目标阳性克隆（阳性菌落）扩（阳性菌落）扩大培养大培养菌菌落落原原位位杂杂交交基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程噬噬菌菌斑斑原原位位杂杂交交基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程3.3 Southern 杂交杂交(Southern blotting)目标目标 DNA 经经过限制性酶切过限制性酶切并通过琼脂糖并通过琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳0.4N NaOH 变性变性1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4）中和中和使使 DNA 仍保持单链状态仍保持单链状态将凝胶上的将凝胶上的 DNA 转移到硝转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上酸纤维素滤膜或尼龙膜上通过通过 80 处理或紫外线照处理或紫外线照射将射将 DNA 固定在滤膜上固定在滤膜上将结合了将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定分子的滤膜先与特定的预杂液进行的预杂液进行预杂交预杂交，将滤膜的空白处用鱼精将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附身对探针的吸附杂交杂交：在一定的溶液条件：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤探针与滤膜混合，如果滤膜上的膜上的 DNA 分子存在与探分子存在与探针同源的序列，那么探针针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上从而吸附在滤膜上 洗膜洗膜：经过一：经过一定的洗涤程序定的洗涤程序将游离的探针将游离的探针分子除去分子除去检测：检测：放射性标记、检测放射性标记、检测非放射性标记、检测非放射性标记、检测 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程分子杂交炉分子杂交炉 紫外交联仪紫外交联仪 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程M，地高辛（，地高辛（DIG）标记的分子）标记的分子量标准（量标准（DNA/Hind）1-3，苏云金芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌 YBT-1520 菌株的总菌株的总 DNA 分别经分别经 Kpn-Pst、Pst 和和 Kpn 酶切酶切以以 cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的杀虫晶体蛋白基因中的 728bp 片段作探片段作探针，通过随机引物标记的方式，用针，通过随机引物标记的方式，用 DIG 标记探针标记探针基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程3.4 Northern 杂交杂交(Northern blotting)(A)RNA is isolated from various tissues and is separated by size using gel electrophoresis.(B)The gel is then placed on a paper wick,which absorbs an ionic solution from a trough(C)A filter that traps RNA is placed above the gel,and blotting paper is placed above the filter.Capillary action draws the solution through the gel,trapping the RNA on the filter(D)The filter is incubated with radioactive single-stranded DNA complementary to the mRNA of interest(E)After any unbound DNA is washed off,autoradiography localizes the mRNA in the samples that contain it.(F)Drawing of a developmental Northern blot showing the presence of Pax6 mRNA in the eye,brain,and pancreas of a mammalian embryo基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程双脱氧法测序双脱氧法测序(Sanger dideoxy procedure)4DNA序列的测定序列的测定(Sanger dideoxy procedure)大规模测序的策略和测序技术的发展大规模测序的策略和测序技术的发展化学法测序化学法测序(Maxam-Gilbert procedure)基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程Frederick SangerDNA的合成过程中，在合成的的合成过程中，在合成的DNA链的链的3末端，依据碱基配对的原则，末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的通过生成新的3，5-磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的链合成终止，产生短的DNA链。产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的链。产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。链。4.1双脱氧法测序双脱氧法测序(Sanger dideoxy procedure)双脱氧法测序双脱氧法测序 原理原理基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程双双脱脱氧氧法法测测序序基基本本过过程程基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程自动测序电泳装置自动测序电泳装置基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程An example of a portion of a chromatogram from automated sequencing Automated sequencing is based on the dideoxy methodology,but four different fluorescent dye-labelled ddNTPs are used.Thus each fluorescent label can be detected by its characteristic spectrum.The products are separated by automated electrophoresis and the bands detected by fluorescence spectroscopy.基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程Sanger测序仪采用测序仪采用96个毛细电泳管的阵列，个毛细电泳管的阵列，可以同时进行可以同时进行96个这样的测序反应，每个反应得个这样的测序反应，每个反应得到的到的Read长度可以达到长度可以达到1000bp以上以上 MEGABACE1000 DNA测序测序仪 基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程多多道道移移液液器器96孔反应板孔反应板基因工程第四章基因操作过程基因工程第四章基因操作过程双脱氧法测序双脱氧法测序