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蛋白酶酶活的测定方法(福林法)1. 酶单位定义:lg固体酶粉(或ImL液体酶),在一定温度和pH值条件下,lmin水解酪 素产生lug酪氨酸为一个酶活力单位,以u /g (u/mL)表示。2. 原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下,水解酪素底物,产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、 色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝和钨蓝,用分光光度法测 定,计算其酶活力。3. 试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2W04.2H20) 100g,钼酸钠 (NaMo0.2H0) 25g,水 700mL、85% 磷酸 50mL、浓盐酸 100mL,小火 242沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂(LiS04) 50g,水50mL和数滴浓 溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷却后仍有绿色需要再加入溴水,再煮沸除 去过量的溴),冷却,加水定容至1000mL,混匀,过滤。制得得试剂应呈金黄色,贮存于棕 色瓶内。使用溶液:一份福林试剂与二份水混合,摇匀。3.2 碳酸钠溶液 c(Na CO ) =0.4mol/L23称取无水碳酸钠(Na2C03)42.4g,加水溶解并定容至1000mL。3.3 三氯乙酸 c (CCl.COOH) =0.4mol/L3称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。3.4 氢氧化钠溶液 c (NaOH) =0.5mol/L按GB601配制。3.5 盐酸溶液 c(HCl) =1mol/L 及 0.1 mol/L 按GB601配制。3.6 缓冲溶液a. 磷酸缓冲液(pH=7.5),适用于中性蛋白酶。称取磷酸氢二钠(NaHP0.12H0) 6.02g和磷酸二氢钠(N aHPO. 2HO) 0.5g,加水溶解242242并定容至1000mL。b. 乳酸缓冲液(pH=3.0),适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸(80%90%) 10.6g,加水溶解并定容至1000mL。乙液 称取乳酸钠(70%) 16g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL,乙液1mL,混匀,稀释一倍,即成0.05mol/l乳酸缓冲溶液。c. 硼酸缓冲溶液(pH=10.5),适用于碱性蛋白酶。甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000mL。乙液 称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液 取甲液500mL,乙液400mL,混匀,用水稀释至1000mL。3.7 10g/l酪素溶液称取酪素10.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则 用浓乳酸23滴)湿润后,加入适量得各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加 热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入lOOOmL容量瓶,用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至 刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。3.8 100卩g/mL L-酪氨酸标准溶液a. 称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸O.lOOOg,准确至0.0002g,用1 mol/L盐酸 60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b. 吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/l盐酸定容至100mL,即得100卩g/mL L- 酪氨酸标准溶液。4仪器和设备4.1 恒温水浴 40C0.2C。4.2分光光度计 应符合GB9721的规定。5 分析步骤5.1 标准曲线的绘制a. L-酪氨酸标准溶液:按表A3配制。表A3管号酪氨酸标准溶液的浓度取100ug/mL酪氨酸标准溶取水的体积u g/mL液的体积mLmL000101101922028330374404655055b.分别取上述溶液各1.00mL (须做平行试验),各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL,福林试剂 使用液1.00mL,置于40C0.2C水浴中显色20min,用分光光度计于波长680nm,10mm比 色皿,以不含酪氨酸的0管为空白,分别测定其吸光度,以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓 度C为横坐标,绘制标准曲线(曲线应通过零点)。根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug),既为吸光度常数K值。其K值应在95100范围内。5.2 测定(1)待测酶液的制备a.称取酶粉12g,精确至0.0002g(或取液体酶1.00mL),用少量该酶的缓冲液溶解,并 用玻璃棒搅拌捣研,将上清液小心倾入容量瓶中,沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 34次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲溶液定容至刻度,摇匀。通过四层纱布过滤,滤液 根据酶活力再用一次缓冲液稀释至适当浓度,供测试用(稀释至被测试液吸光值在 0.250.40范围内)。b.酶粉测定时,稀释倍数参考表4 (液体酶液可参照表4稀释)。表4酶活单位 总 倍 第一次稀释 第二次稀释数2万20002g-200mL (100 倍)5mL-100mL (20 倍)3万25002g500mL(250倍)5mL-50mL (10 倍)4万40002g200mL(100倍)5mL-200mL (40 倍)5万50002g500mL(250倍)5mL-100mL (20 倍)8、10 万100002g-500mL(250 倍)5mL-200mL (40 倍)(2)测定a先将酪素溶液放入40C0.2C恒温水浴中,预热5min。b 按下列程序操作于660nm波长,用10mm比色皿测其吸光度c. 1.398和166蛋白酶,除反应与显色温度为300.2C外,其他操作同5.2,标准曲线也 作同样处理。5.3 计算 X=AxKX4/10Xn=2/5XAxKXn式中,X样品的酶活力,u /g (u/mL);A样品平行试验的平均吸光度;K吸光常数(K=97.09实验室测定值)4反应试剂的总体积,mL;10反应时间1 Omin,以1min计;n一稀释倍数5.4 结果的允许差 平行试验相对误差不得超过3%。需要准备的:麸皮,面粉,水,纱布,福林试剂,250ml三角瓶,每组1015支试管,分 光光度计,三氯乙酸,磷酸缓冲液或水,碳酸钠溶液,酪素,已传代好的试管斜面。 最好能镜检一下真菌菌丝的形态。试管A (空白)试管B (酶试样,需作三个平行)加酶液1.00ml加酶液1.00ml40+0.2C,预热 2min40+0.2C,预热 2min加三氯乙酸2.00ml摇匀加酪素1.00ml,摇匀40+0.2C,保温 10min40+0.2C,保温 10min加酪素1.00ml,摇匀加三氯乙酸2.00ml摇匀取出静置10min,过滤取出静置10min,过滤取1.00ml滤液取1.00ml滤液加碳酸钠溶液5.00ml加碳酸钠溶液5.00ml加福林试剂使用液1.00 ml加福林试剂使用液1.00 ml40+0.2C,显色 20min40+0.2C,显色 20min
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