蛋白酶酶活测定方法(福林法)

蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义：lg固体酶粉（或ImL液体酶），在一定温度和pH值条件下，lmin水解酪 素产生lug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g （u/mL）表示。2. 原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、 色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测 定，计算其酶活力。3. 试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2W04.2H20） 100g,钼酸钠 （NaMo0.2H0） 25g，水 700mL、85% 磷酸 50mL、浓盐酸 100mL，小火 242沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiS04） 50g，水50mL和数滴浓 溴水（99%）,再微沸15min,以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除 去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕 色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。3.2 碳酸钠溶液 c（Na CO ） =0.4mol/L23称取无水碳酸钠（Na2C03）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。3.3 三氯乙酸 c （CCl.COOH） =0.4mol/L3称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。3.4 氢氧化钠溶液 c （NaOH） =0.5mol/L按GB601配制。3.5 盐酸溶液 c（HCl） =1mol/L 及 0.1 mol/L 按GB601配制。3.6 缓冲溶液a. 磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。称取磷酸氢二钠（NaHP0.12H0） 6.02g和磷酸二氢钠（N aHPO. 2HO） 0.5g，加水溶解242242并定容至1000mL。b. 乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸（80%90%） 10.6g，加水溶解并定容至1000mL。乙液 称取乳酸钠（70%） 16g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL，乙液1mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/l乳酸缓冲溶液。c. 硼酸缓冲溶液（pH=10.5），适用于碱性蛋白酶。甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g,加水溶解并定容至1000mL。乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液 取甲液500mL，乙液400mL，混匀，用水稀释至1000mL。3.7 10g/l酪素溶液称取酪素10.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则 用浓乳酸23滴）湿润后，加入适量得各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加 热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入lOOOmL容量瓶，用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至 刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。3.8 100卩g/mL L-酪氨酸标准溶液a. 称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸O.lOOOg，准确至0.0002g，用1 mol/L盐酸 60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b. 吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/l盐酸定容至100mL,即得100卩g/mL L- 酪氨酸标准溶液。4仪器和设备4.1 恒温水浴 40C0.2C。4.2分光光度计 应符合GB9721的规定。5 分析步骤5.1 标准曲线的绘制a. L-酪氨酸标准溶液：按表A3配制。表A3管号酪氨酸标准溶液的浓度取100ug/mL酪氨酸标准溶取水的体积u g/mL液的体积mLmL000101101922028330374404655055b.分别取上述溶液各1.00mL （须做平行试验），各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL，福林试剂 使用液1.00mL，置于40C0.2C水浴中显色20min,用分光光度计于波长680nm,10mm比 色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓 度C为横坐标，绘制标准曲线（曲线应通过零点）。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（ug），既为吸光度常数K值。其K值应在95100范围内。5.2 测定（1）待测酶液的制备a.称取酶粉12g，精确至0.0002g（或取液体酶1.00mL）,用少量该酶的缓冲液溶解，并 用玻璃棒搅拌捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研 34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀。通过四层纱布过滤，滤液 根据酶活力再用一次缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在 0.250.40范围内）。b.酶粉测定时，稀释倍数参考表4 （液体酶液可参照表4稀释）。表4酶活单位 总 倍 第一次稀释 第二次稀释数2万20002g-200mL （100 倍）5mL-100mL （20 倍）3万25002g500mL（250倍）5mL-50mL （10 倍）4万40002g200mL（100倍）5mL-200mL （40 倍）5万50002g500mL（250倍）5mL-100mL （20 倍）8、10 万100002g-500mL（250 倍）5mL-200mL （40 倍）（2）测定a先将酪素溶液放入40C0.2C恒温水浴中，预热5min。b 按下列程序操作于660nm波长，用10mm比色皿测其吸光度c. 1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为300.2C外，其他操作同5.2,标准曲线也 作同样处理。5.3 计算 X=AxKX4/10Xn=2/5XAxKXn式中，X样品的酶活力，u /g （u/mL）；A样品平行试验的平均吸光度；K吸光常数（K=97.09实验室测定值）4反应试剂的总体积，mL；10反应时间1 Omin，以1min计；n一稀释倍数5.4 结果的允许差 平行试验相对误差不得超过3%。需要准备的：麸皮，面粉，水，纱布，福林试剂，250ml三角瓶，每组1015支试管，分 光光度计，三氯乙酸，磷酸缓冲液或水，碳酸钠溶液，酪素，已传代好的试管斜面。 最好能镜检一下真菌菌丝的形态。试管A （空白）试管B （酶试样，需作三个平行）加酶液1.00ml加酶液1.00ml40+0.2C,预热 2min40+0.2C,预热 2min加三氯乙酸2.00ml摇匀加酪素1.00ml,摇匀40+0.2C,保温 10min40+0.2C,保温 10min加酪素1.00ml,摇匀加三氯乙酸2.00ml摇匀取出静置10min,过滤取出静置10min,过滤取1.00ml滤液取1.00ml滤液加碳酸钠溶液5.00ml加碳酸钠溶液5.00ml加福林试剂使用液1.00 ml加福林试剂使用液1.00 ml40+0.2C,显色 20min40+0.2C,显色 20min