6、基因组不稳定性

分子机制研究套路(六)基因组不稳定性课题：A肿瘤的微卫星不稳定与染色体不稳定研究1概念介绍：微卫星(microsateHite ,MS)是由1-6个核普酸组成，具有高度多态性的简单串联重复序列，广 泛分布于整个基因组DNA序列中，复制过程中易于发生改变，人类基因组中最常见的微卫 星序列是胞嘧啶和腺嘌呤的二聚体(CA ),尽管微卫星序列在个体之间存在广泛的多态性， 但在个体内部保持一定的稳定性，而且能在后代中保持遗传的稳定，因此微卫星序列是重要 的遗传标志，可以作为遗传学研究的标志。微卫星不稳定性(MSI)是这些简单重复序列的改 变,MSI只有在许多细胞都发生同样的改变才能被检测出，是肿瘤细胞克隆性增殖的一个扌指 标。错配修复功能下降会引起DNA复制错误增加，导致MSI，目前研究表明MSI是错配修 复基因失活的一个重要表型。MSI检测的方法较多，常用的检测方法有变性凝胶电泳、基因 扫描、变性高效液相色谱分析等方法。基因扫描法将微卫星位点的PCR引物在一端进行荧 光标记，然后扩增该微卫星位点，将PCR扩增产物在荧光毛细管中进行电泳，以基因扫描 进行分析得出不同条带的碱基数，从而确定其大小，该方法的敏感性较高，可以高通量检测 微卫星位点。染色体是细胞遗传的物质基础，分子细胞遗传学研究表明大多数肿瘤细胞特别是实体瘤细胞 在发生发展的过程中都存在染色体片段的非随机异常，表现为染色体数目或结构的改变，这 些改变与原癌基因的扩增和抑癌基因的缺失密切相关。染色体不稳定(CIN)包括整条染色体 的获得或缺失(非整倍体)、杂合性缺失、染色体易位、重排、基因扩增导致的染色体均染区、 双微体等。细胞核中DNA含量直接反映细胞核酸代谢水平和生长增殖活性，正常细胞核DNA的含量比较稳定，多以二倍体形式出现，肿瘤细胞的DNA含量增高，多为非整倍体。测定细胞核DNA的含量可直接反映肿瘤细胞增殖状态,在判断肿瘤的恶性程度及预后方面有重要意义。2研究思路：2.1A肿瘤的微卫星不稳定（MSI）研究22.1.1A肿瘤中MSI检出率22.1.2A肿瘤的MSI与临床病理特征的关系32.2A肿瘤的DNA倍体分析32.2.1DNA倍体分析结果32.2.2A肿瘤的DNA倍体分析与临床病理特征的关系32.3比较基因组杂交（CGH ）研究A肿瘤的染色体变异32.3.1CGH 分析结果 3.2.3.2染色体变异数与临床病理特征的关系32.4染色体变异与DNA倍体的关系42.5染色体变异与MSI的关系42.1A肿瘤的微卫星不稳定（MSI）研究2.1.1A肿瘤中MSI检出率首先需要明确所研究肿瘤类型的微卫星敏感位点MSI-1和MSI-2 （例如：单碱基重复序列 BAT25和BAT26是检测散发性结直肠癌MSI高度敏感的位点）然后设计引物，并在引物 上游或下游标记荧光染料，应用荧光标记多重PCR法扩增微卫星位点MSI-1和MSI-2，应 用全自动DNA测序仪和Genescan3.1软件对A肿瘤进行MSI分析。结果显示：N例A肿瘤患者中，MSI-1和MSI-2两个位点均阳性者一例，MSI-H发生率为 -% ； MSI-L发生率为_ % ,其中MSI-1单位点阳性者一例，MSI-2单位点阳性者一例；两 个位点均阴性者_例，MSS发生率为_ %。2.1.2A肿瘤的MSI与临床病理特征的关系考察A肿瘤中MSI-H、MSI-L和MSS组别在性别、年龄、组织类型、分化程度、肿瘤浸润 深度、淋巴结转移、远处转移等方面是否有统计学差异。2.2A肿瘤的DNA倍体分析2.2.1DNA倍体分析结果通过流式细胞仪分析一例A肿瘤标本中，二倍体为一例，占_ % ；异倍体为一例，比例为_ %。2.2.2A肿瘤的DNA倍体分析与临床病理特征的关系结果显示，A肿瘤的DNA倍体与患者的性别、年龄及组织学类型无明显相关性。低分化癌 异倍体发生率高于高、中分化癌，但均未达到统计学差异(P0.05)。DNA倍体与患者的TNM 分期有密切关系，分期越高，异倍体的比例越高，统计学有显著差异。2.3比较基因组杂交(CGH )研究A肿瘤的染色体变异2.3.1CGH 分析结果在CGH检测的_例A肿瘤中，所有病例均有不同程度的染色体臂发生扩增或丢失。_例A 肿瘤中共有_处染色体臂变化，其中_处扩增和_处丢失。平均每例变异数为_，其中扩增 数为_，丢失数为_，扩增数明显多/少于丢失数，其比例为_。将_例A肿瘤出现染色体 异常的性质及区域定位总结于一张CGH概貌图，常见的染色体扩增区域(20%)有：_,_, 等；常见的染色体丢失区域(20%)有: ，等。2.3.2染色体变异数与临床病理特征的关系TNM分期中111、IV期A肿瘤的染色体总变异数和扩增数、缺失数均高于I、 11期，两者差异有统计学意义。肿瘤部位、组织学类型、分化程度等与染色体总 变异数、扩增数和丢失数比较差异均无统计学意义。常见的染色体扩增区域中一区域与TNM分期有关，111、IV期A肿瘤一区域扩增数 明显高于I、11期，一区域、一区域和一区域与TNM分期无明显关系。常见缺失区域一区 域、一区域和一区域等与A肿瘤的临床分期间差异均无统计学意义2.4染色体变异与DNA倍体的关系_例二倍体A肿瘤共有一处染色体臂变化，其中_处扩增和_处缺失，平均每例染色体变 异数为_，扩增数为一，缺失数为_。_例异倍体MSS的A肿瘤共有一处染色体臂变化， 其中处扩增和处缺失，平均每例染色体变异数为_，扩增数为，缺失数为_。二倍体 与异倍体两者在染色体总变异数及缺失数上有显著差异。二倍体常见的染色体扩增区域(20%)有：_,_,_等;二倍体常见的染色体丢失区域(20%) 有：_,_,_等。异倍体常见的染色体旷增区域(20%)有：_,_,_等；异倍体常见的 染色体丢失区域(20%)有： _，_，_等。2.5染色体变异与MSI的关系_例MSI-H的A肿瘤共有_处染色体臂变化，其中_处扩增和_处缺失，平均每例染色体 变异数为，扩增数为，缺失数为_。_例MSS的A肿瘤共有处染色体臂变化，其中 _处扩增和_处缺失，平均每例染色体变异数为_，扩增数为_，缺失数为_。 MSI-H 与 MSS 两者在染色体总变异数及缺失数上有显著差异。MSI-H常见的染色体扩增区域(20%)有：_,_,_等；MSI-H常见的染色体丢失区域(20%) 有： _，_，_等。 MSS 常见的染色体扩增区域(20%)有： _，_，_等； MSS 常见的染 色体丢失区域(20%)有： _，_，_等。