外源基因的表达及其优化策略.ppt

生命科学学院,第七章 外源基因的表达及其优化策略,第一节影响外源基因表达的因素 第二节外源基因在原核细胞中的表达 第三节外源基因在真核细胞中的表达,生命科学学院,本章重点掌握内容,基因表达的关键要素及要求 影响外源基因表达的因素 表达产物的纯化 甲醇酵母表达系统,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,基因表达： 从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息,通过密码子和反密码子系统,转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。,基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,基因表达 遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,影响外源基因表达的因素主要有： 阅读框架 顺式作用元件 翻译过程 表达体系,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,一、阅读框架对转化基因的影响 什么是阅读框架(open reading frame, ORF)? 二、顺式作用元件对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控 1)启动子 2)增强子 3)沉默子,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,二、顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控 1)终止子 2)衰减子 3.对DNA结构的影响 1)核基质结合区 2)绝缘子 3)基因座控制区,生命科学学院,第一节影响外源基因表达的因素,三、翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响 四、表达系统对表达产物的影响,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。,宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞： 酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。,目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,用原核生物作宿主。,A dividing E. coli,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 真核与原核生物结构上存在差别,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,转录和翻译偶联、连续进行,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,一、原核生物细胞表达的特点 6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即SD序列。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,二、外源基因在原核细胞中表达具备条件 1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。 2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。 3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。 4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。 5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,原核生物基因表达载体的组成特征 启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子 原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统,生命科学学院,大肠杆菌表达载体的基本成分,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 （1）启动子序列 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,-35 Box 和 -10 Box,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,不同启动子的consensus sequences,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列 -35box：RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5-TTGACA-3 -10box（Pribnow Box）：5-TATAAT-3,TTGACA,TATAAT,转录起始位点,17bp,5,核糖体结合位点,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,原核启动子共有序列的功能,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS） Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 S-D序列距离AUG的距离也影响翻译 b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 原理： 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 多聚A/U 由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 4. 翻译终止密码 大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。 5. 翻译增强子（Translation enhancer） 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体,1. 非融合型表达载体,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 1）强启动子: tac（trp-lac） 2）操纵基因：乳糖操纵子系统。,trp的-35区,lacUV5的-10区,lac操纵基因,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。 4）终止子：rrnB的强终止子 S-D序列和插入位点区：,S-D,插入位点区,Lac I,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 6）载体的其余部分：来自pBR322质粒。 7）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,tac P,Lac O,S-D,插入位点区,rrnB T,宿主lac I,阻遏物,IPTG,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体：,条件： 必须选择一个有lacI的宿主菌。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pIN III系列：,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 pIN III系列 组成结构 1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 2）调节基因：lac I 。 3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位点,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,pIN III-comA1,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 如：pGEX系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。 组成结构： 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,产物提纯:,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,pGEX-2X的插入区,pGEX-1X的插入区,pGEX-3X的插入区,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统,pGEX系列插入区,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 4.其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签） 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式,位于,细胞质,细胞周质,细胞外,表达产物,形式,包涵体蛋白,融合蛋白,整合型外源蛋白,分泌型外源蛋白,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,细胞质中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会 发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。 包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚 集折叠而成的晶体结构物。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,蛋白质的合成是在细胞之中进行的 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总 蛋白的20%40%。 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于 本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分 泌到周质空间，或外泌到培养液中。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,周质中表达： 周质：在大肠杆菌一类革兰氏阴性菌中，位于内 膜和外膜之间的细胞结构部分。 在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细 胞质中穿过细胞质内膜进入周质。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,胞外表达： 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质， 分泌到胞外培养基中进行分离纯化。,途径： 1. 用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分 泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特 别有效的程序） 2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏， 导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。 （可以分离到中等产量的蛋白质）,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 1.包涵体蛋白 本质：细胞内蛋白质的不断聚集 包括：1.折叠状态的蛋白质的聚集作用； 2.非折叠状态的蛋白质的聚集作用； 3.蛋白质的中间体结构。 优点：易于分离纯化,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 包涵体基本由蛋白质组成，其中大部分是外源基因的表达产物，具有正确的AA序列，但空间构想往往是错误的，因而没有活性，此外，它还含有受体细胞本身高效表达的蛋白产物（如RNA聚合酶、外膜蛋白等），以及质粒的编码蛋白，其第三种组分是DNA、RNA、脂多糖等非蛋白分子。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细 菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白 。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生 物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收 率至关重要。 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性， 有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,形成包涵体的原因： 缺少真核生物中翻译后修饰所需的酶，使中间体大量积累。 缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅因子，或环境不适无法 形成正确的次级键。 表达水平（重组异源蛋白过量表达）。 细菌的遗传性状。 异源蛋白氨基酸序列（含硫氨基酸越多越容易）。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,减少形成包涵体的策略： 降低重组菌的生长温度 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂（高浓度多醇类、蔗糖） 供给丰富的培养基，创造最佳培养基（供氧、pH等）,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,包涵体的分离： 菌体破碎（高压匀浆、高速碾磨、低温反复冻融等） 离心收集（高速离心） 清洗（去污剂和低浓度变性剂洗涤以除去脂类和膜蛋白）,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,包涵体的变性与复性操作 包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键。在 人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。 能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清 洗 剂 SDS、正十二醇肌氨酸 促 溶 剂 盐酸胍、尿素 混 合 溶 剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用， 溶解力增强 极 端 pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠 包涵体的复性与重折叠的主要任务： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,包涵体蛋白质的折叠复性效率取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争，涉及两种疏水作用： 分子内疏水相互作用，可促进正确折叠； 部分折叠肽链分子间的疏水相互作用，会导致蛋白质聚集。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,一个有效、理想的折叠复性方法应具备的特点： 活性蛋白质的回收率高 正确复性的产物易于与错误折叠的蛋白质分离 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品 折叠复性方法易于放大 复性过程耗时较少,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 2.融合蛋白 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，这种方式表达的蛋白. 优点： 稳定性加强；具有较高的水溶性和一定的生物活性；能高效表达；易于分离纯化.,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的或是应用DNA 重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上不同基因的 核苷酸序列的新型基因。,融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序 列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。其中通常 受体细菌蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,融合蛋白质配偶体：指融合蛋白质中与目标 蛋白质连接的别种蛋白质组分。 常见的配偶体：葡萄球菌蛋白质A(SPA)、链 球菌蛋白质G(SPG)、谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 、 麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白(Trx)。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,融合蛋白表达系统的构建的三个原则： 首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其 表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。 其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游 区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个 结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接 决定了融合蛋白的裂解方法。 最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外 源基因的表达取决于其正确的翻译阅读框架。,生命科学学院,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,用融合载体组合表达融合蛋白质： 以Ecoli. lacZ为靶基因的组合最典型，含三个不同 载体，每个载体都有一个lacZ启动子和SD序列，且在 lacZ基因下游部位具有一EcoR识别序列 (GAATTC) 5上游存在着不同数量的G-C碱基对。三种情况必有一 个保持着正确的读码结构，产生出真实的融合蛋白质。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,生命科学学院,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因(mtld) 引物 引物1：5GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTGGCG 3 引入BamHI酶切位点 引物2：5TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG3 引入SacI酶切位点,全长1149bp，382个氨基酸，45kD,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,融合蛋白质表达系统的优点： 第一个显著特点是稳定性大大增加。 第二个特点是融合蛋白质的多肽片段有可能构成 信号肽序列指导蛋白质分配到细胞的正确部位。 第三个特点是分离纯化简单。可根据受体细菌蛋 白的特异性抗体、配体底物等迅速纯化融合蛋白质。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,融合蛋白质的纯化 基本原理： 利用与融合蛋白质配偶体相对应的配 体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体 之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其 它蛋白质则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到纯化 的融合蛋白质。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,异源蛋白质的回收： 将其中大肠杆菌多肽组分切除掉。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种。 化学断裂法：最佳试剂为溴化氰，作用于甲硫氨酸侧链进行硫醚基反应，后水解断裂。 蛋白质酶法：每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 3. 整合型外源蛋白 外源蛋白的基因序列在宿主细胞染色体的同源序列的介导下，整合到宿主细胞的染色体上，进行表达的方式。 4.分泌型外源蛋白 编码的外源蛋白在某种机制下分泌到细胞外的这类蛋白。 优点： 简化纯化处理工艺；减少外源蛋白降解的概率；有利于形成正确地空间构想，获得较好的生物活性或免疫原性,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,蛋白质的外泌表达型 把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解，也有利于分离纯化。 目前成功的例子主要是采用以下方案: （1）与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达 （2）与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达 （3）改变培养基的成分 归纳现有的研究结果显示这些方法仅对外泌分子量较小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比较低。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 1. 选择强启动子序列，如tac 等 2. 调整S-D序列与AUG碱的距离 一般为5-9bp 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离 3. 改变起始密码下面的几组密码子 能提高翻译的起始效率 4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系 （1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开 一般采用温度诱导或药物诱导 PL启动子是温度诱导型:,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）诱导表达 tac启动子是药物诱导型 调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。 无IPTG 阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。 有IPTG 阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,AmpR,Plasmid pGEX-KG,GST,lacIq,Ptac Promoter,Ampr,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 （2）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。,当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。,当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。 （1）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。 1)使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 2)大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 3)T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件： 有信号肽:位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。,碱性氨基酸,N,疏水氨基酸核心区,切割位点,Arg、Lys,Leu、Ile,AlaGlySer,信号肽酶,外源蛋白,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,六、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件： 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列:为蛋白指明目的地。 细胞内的转运机制:信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。 真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,七、表达产物的检测 1.western blotting,前提是：表达产物是已知蛋白,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,七、表达产物的检测 2. HPLC高效液相层析,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,七、表达产物的检测 3.聚丙烯酰胺凝胶电泳,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,七、表达产物的检测 4.等电聚焦电泳,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,七、表达产物的检测 5.双向电泳,生命科学学院,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,七、表达产物的检测 6.免疫电泳 7.放射免疫测定 8.酶联免疫吸附试验,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,原核表达系统与真核表达系统的区别？ 1.原核表达系统的表达系统是原核细胞; 真核表达系统则是在真核细胞里例如酵母细胞, 昆虫细胞, 哺乳动物细胞中表达。 2.两种表达系统都是通过含有原核或者真核启动子以及其他其他表达相关元件的质粒系统来实现外源基因的表达。 3.原核表达系统与真核表达系统相比,表达量效率便于优化调整,表达量高. 但用来表达真核来源的外源基因时,由于蛋白折叠和糖链修饰不同,因此其应用受限. 真核表达系统表达量相对较低, 虽然酵母和昆虫系统表达量相对较高,但是在表达哺乳细胞来源基因同样存在折叠和糖链修饰的不足。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,一、真核生物基因表达与调控的特点 1.基因组DNA的存在形式可影响基因表达 2.转录与翻译不偶联 3.调控是多层次的 4.具有组织和细胞类型特异性 5.对信号分子反应不同,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,二、真核生物基因表达载体的组成特征,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,二、真核生物基因表达载体的组成特征 1.原核DNA序列 2.启动子 组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、 杂合启动子 3.增强子 4.终止子 5.内含子 6.polyA加尾信号 7.选择标记基因和报告基因,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,三、真核表达的受体系统 1.酵母表达系统 酵母是一类最简单的真核生物,其生长代谢与原核生物相似；但在基因表达与调控方面类似于高等生物。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,B 常用的宿主 酿酒酵母宿主菌 巴斯德毕赤酵母宿主菌 乳酸克努维酵母宿主菌 多型汉森酵母宿主菌,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。,由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,C 酵母基因表达载体 酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代DNA和RNA单位。,酵母菌中的野生型质粒,酵母菌克隆表达质粒的构建,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,DNA复制起始区（含两类复制起始序列） 选择标记（营养缺陷型或显性选择标记） 有丝分裂稳定区 表达盒(启动子、分泌信号序列、终止子等),生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE,但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,酵母基因表达载体的种类： YRp类（yeast replication plasmid 自主复制型质粒） YEp类（yeast episomal plasmid 附加体质粒） YIp类（yeast integrative plasmid 整合型质粒） YCp类（yeast centromeric plasmid 着丝粒质粒） YAC 酵母人工染色体,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,含有ARS的YRp质粒的构建： ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2质粒上的复制元件为复制子的质粒称为Yep 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建: 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,含有CEN的YCp质粒的构建: CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,D 酵母菌的转化系统,酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、 热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,酵母菌电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105 /gDNA。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母表达系统,酿酒酵母基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌；且发酵过程中产生乙醇。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,乳酸克鲁维酵母表达系统,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因 此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达 2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不 易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中， 能够筛选到高表达菌株 3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动 子特别适用于外源基因的调控表达,巴斯德毕赤酵母表达系统,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外 源蛋白容易从培养基的基质中分离 5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N-乙酰糖基化修饰的结构为 高甘露糖型，糖链平均为814个甘露糖基，更接近于高等生 物，且聚糖末端不含 1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性) ，因而适用于临床应用 6、使用方便、简单，而且成本较低,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,生长迅速 乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子 表达的可诱导性,已有百余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母 系统中获得成功表达。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,甲醇酵母表达系统, 甲醇酵母的生物学 AOX1 and AOX2 Mut+ and Muts 表达载体和受体菌 pPIC3.5K（胞内表达） pPIC9.3K（分泌表达） pAO815 （多拷贝表达）,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,载体结构上的共同点：,5AOX1 重组位点 MCS 多克隆位点 TT 转录终止和多聚腺苷酸化序列 3AOX1 重组位点 His4 重组位点 筛选标记 Ampr 筛选标记,生命科学学院,甲醇酵母表达系统中常用载体的基本结构,5AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达； -因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3 AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。,生命科学学院,pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点,生命科学学院,1. 载体的3 AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组,表达载体与甲醇酵母基因组发生重组的方式：,2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组,生命科学学院,利用甲醇酵母表达系统进行NGAL蛋白外源表达进行验证的实验技术路线： 构建表达载体转化至酵母菌中筛选阳性转化单克隆筛选高表达单克隆,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,甲醇酵母表达系统的优点,强启动子 可进行翻译后加工 营养要求低 可高密度发酵 表达高 表达的蛋白质可胞内也可胞外 糖基化程度低,生命科学学院,甲醇酵母表达外源蛋白示例,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,影响目的基因在酵母菌中表达的因素, 外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率 启动子 分泌信号的效率 终止序列的影响 外源蛋白的糖基化 宿主菌株的影响 菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定 分泌能力强,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,在酵母中高效表达的策略,选择合适的受体细胞系统 提高表达载体在细胞中的拷贝数 提高外源基因转录水平,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,三、真核表达的受体系统 2.昆虫表达系统 昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统,它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。 利用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达系统； 另一类新型的昆虫细胞表达系统,则是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础之上的,在稳定性和表达效率方面有着更为突出的优点。,生命科学学院,第三节 真核细胞表达系统概述,三、真核表达的受体系统 2.昆虫表达系统 昆虫表达系统的缺点 1. 载体大量复制，最终导致宿主细胞或幼虫死亡，不能连续生产外源蛋白。 2. 昆虫细胞对蛋白产物的糖基化方式与哺乳动物有所差异，可能影响到产物蛋白的活性和免疫原性。 3. 昆虫细胞的大规模培养费用大。,生命科学学院,第三节 真核细胞表达系统概述,三、真核表达的受体系统 3、哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化和准确的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。 根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。,生命科学学院,第三节 真核细胞表达系统概述,三、真核表达的受体系统 4.植物表达系统 以植物个体、果实或器官作为生物反应器,将目标基因与植物病毒或特定的植物调控元件构建融合基因,以此制造转基因植物,目标基因将在预定时期和部位表达。该系统在启动期需较大资金投入,一旦获得预期的转基因植株,便可以极低的成本进行大规模的生产。其缺憾为产物的翻译后修饰与动物有些不同,这限制了其应用范围。美国一家公司已用转基因香蕉生产出了疫苗。,生命科学学院,第三节 外源基因在真核细胞中的表达,主要基因工程表达体系比较,生命科学学院,OVer!,