常用饲用酶制剂检测方法介绍.ppt

几种酶制剂检测方法介绍,饲料酶制剂,现市场上常见的饲料酶制剂多为复合酶，其成分木聚糖酶、-淀粉酶、（酸性或中性）蛋白酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、-葡聚糖酶中的几种。 如何准确检测其中的一种酶制剂的活性？,酶制剂检测原理,酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性。,酶制剂检测原理,样品检测： 酶制剂检测应用酶对底物专一性的特点，采用高纯度底物，专一检测某种酶制剂对底物的降解，然后测定产物含量（分光光度计）。 标准曲线： 通过用其高纯度的产物制作标准曲线，通过分光光度计的读数查出对应的产物含量，然后计算酶活。,酶制剂检测原理,A. -淀粉酶,1.碘淀粉显色法 利用淀粉遇碘变蓝的反应，检测出未被淀粉酶分解的淀粉，运用分光光度计测定碘反应蓝值的变化，然后查表读取酶活。 特点：测定-淀粉酶的碘淀粉显色法是专一性较高、操作较简便、准确性也较高的方法。,A. -淀粉酶,2. DNS显色法 原理：淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，将3，5二硝基水杨酸试剂还原生成3氨基5硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。 特点：专一性不高，易受其他淀粉酶（主要是-淀粉酶）的干扰，因此，碘淀粉显色法应用较多。,B. 蛋白酶,1. Folin法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，产生酪氨酸等酚基氨基酸，在碱性条件下，酚基氨基酸与Folin试剂反应生产蓝色物质，于680nm比色测定光吸收值，计算酶活力。 该法的准确性及灵敏度都较高，在国内已得到公认，是应用最广的方法，我国的部颁标准及各大酶制剂生产企业都采用该法。,B. 蛋白酶,2. 紫外分光光度法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，产生酪氨酸等酚基氨基酸，利用酪氨酸在280nm处有特征性吸收峰,测定计算酶活。 特点：紫外线操作比Folin法简便，但灵敏度仅为Folin法的1/10。,C. 产还原糖酶制剂,现今采用的还原糖法通常是比色法，黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。显色反应与不同聚合度同源寡糖还原性末端的含量成正比。 特点：易于操作，价格低廉，方便快速，重复性好,C. 产还原糖酶制剂,能产生还原糖的酶有：包括纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶等。 半纤维素酶是分解半纤维素(包括各种降戊糖与聚己糖)的一类酶的总称,主要包括-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。,C. 产还原糖酶制剂,1. 还原糖法 2. 粘度法 3. 琼脂平板扩散法 4. 可溶性的染色底物,1. 还原糖法,还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。,2. 粘度法,原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使粘度下降，通过粘度计测定流速改变来计算酶活力。该法灵敏度较高，可形象反映外切酶在动物体内的作用方式，较适宜于饲用酶活性的测定。 特点：重复性差 ，费时、操作复杂、单位难以换算成国际单位 。,3. 琼脂平板扩散法,原理：将NSPS 底物与琼脂混融制成琼脂平板，将酶样点于琼脂板上的小孔中，培养一定时间，选用能与底物发生显色反应的显色剂染色，显示出染色背景区和无色透明的水解区，水解区直径与酶量的对数呈正相关，由水解区直径计算酶活力。 特点：灵敏度高，是还原糖法的100倍，测定所需样品量微，无需特殊设备。,4. 可溶性的染色底物,原理：人工合成的含色原基团的底物在酶的作用下释放出有色物质，利用分光光度计比色测定有色物质含量，计算酶活力。 特点：重复性好，操作简便，灵敏度较高 ，但合成底物与天然底物有区别，对结果的准确性可能有影响 ，并且底物昂贵。,D. 脂肪酶,原理：脂肪酶在一定条件下 ，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所释放的脂肪酸，可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH或酚酞指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活。 反应式为： RCOOH + NaOH RCOONa + H2O,E. 植酸酶,1.国标法（钒钼酸铵法） 原理：利用植酸酶水解植酸钠产生无机磷，再加入酸性钼钒试剂终止反应，同时与无机磷反应生成黄色钒钼磷络和物，在415nm比色测定含磷量，再以标准植酸酶为参照物，间接计算被测样品中植酸酶的含量。,E. 植酸酶,2.硫酸亚铁钼蓝法 原理：利用植酸酶可以水解植酸酶释放无机磷的原理，通过加入盐酸使水解反应停止，然后加入钼酸铵及FeSO47H2O的混合液使溶液显色，在720nm波长下测定其吸收值，以标准酶为参照物，间接计算被测样品中植酸酶的含量。,E. 植酸酶,3.丙酮磷钼酸铵法 原理：磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后，可慢慢生成黄色磷钼酸铵，加入丙酮后使黄色物质提出来，在355nm波长处测吸光度，灵敏度增加10倍。 特点：钒钼酸铵法灵敏度最高，丙酮法稳定性最好，抗干扰能力较强。,E. 植酸酶,4. VC钼蓝法 原理：该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理，通过加入三氯乙酸使反应停止，然后加人钼酸铵与VC的混合液，使溶液显色，在820nm波长下测定吸光度，再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方程，最后以待测样品吸光度代人方程，计算出酶活性。,影响酶活力的主要因素,A.底物种类和浓度 B.酶活力单位定义 C.酶反应pH值 D.酶反应温度 E.酶反应时间,A.底物种类和浓度,同种方法采用不同底物测定，结果相差很大。 例如木聚糖酶的检测，燕麦木聚糖与桦木木聚糖的测定结果就有明显差距。,底物浓度对酶反应速度的影响图,B. 酶活力单位定义,国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。 酶活计算公式： 酶活性 (U/g) = A D 1000 0.210150.13 W 其中: A 比色测定的木糖量，mg/ml； D 稀释倍数； 1000 当量换算因数，mmol- umol ； W 酶样品重量，g； 150.13 木糖的分子量，mg/mmol； 10 反应时间，分钟。,B. 酶活力单位定义,木聚糖酶的活性定义A：在测定条件下，1秒钟从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量。 酶活计算公式： 酶活（IU）= A D 1,000,000 0.2 600 150.13 W 其中: A 比色测定的木糖量，mg/ml； D 稀释倍数； 1,000,000 当量换算因数，mmol- nmol； W 酶样品重量，g； 150.13 - 木糖的分子量，mg/mmol。 600 反应时间，秒。,C. 酶反应pH值,pH影响酶活力的因素: 影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。影响酶与底物的结合，极度pH的条件引起酶蛋白的变性。,C. 酶反应pH值,最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。 最适pH一般接近在48 之间.,D. 酶反应温度,温度对酶促反应速度的影响有两个方面： 提高温度，加快反应速度。 提高温度，酶变性失活。 这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。 最适温度就是这两种因素综合作用的结果。,D. 酶反应温度,E. 酶反应时间,酶反应方程式： 随着生成物浓度的增加，酶反应速度减慢，当生成物达到某一浓度，酶反应即停止。,E. 酶反应时间,从图中可以看到，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，由于底物浓度降低，产物反馈抑制，逆反应速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反应速度逐渐下降，最后完全停止。,E. 酶反应时间,在测定酶促反应速度时，要避免以上干扰因素，必须在酶促反应初期进行，在最初这段时间内的反应速度称之为反应初速度，在过量的底物存在下，反应初速度与酶浓度成正比。,F.激活剂、抑制剂,凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。 激活剂作用包括两种情况：一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。另一种是激活酶原，无活性有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质。,G.举例,2种木聚糖酶测定方法的比较,G.举例,木聚糖酶测定结果,THE END THANK YOU!,