实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳,安徽师范大学生科院生化教研室,生物化学实验之二,一、实验目的与要求,了解电泳技术的一般原理 学习醋酸纤维素薄膜电泳操作技术 测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量,二、实验原理,1.电泳 是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离 2. 影响电泳迁移率的因素： 内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点,4. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。,三、实验器材,1. DYY-6C型 双稳定时电泳仪和DYY-型电泳槽，均为北京市六一仪器厂生产 2. 醋酸纤维薄膜（2 cm8cm） 3. 培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4. 点样器 5. 滤纸 6. 载玻片 7. 镊子 8. 玻棒,四、实验试剂,巴比妥-巴比妥纳缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06) 称取1.66g巴比妥(AR)和12.76g巴比妥纳(AR)，置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，置4保存，备用。 2. 血清蛋白染色 (1)染色液(0.5氨基黑10B)：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇(AR)50ml，冰乙酸(AR)10ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。 (2)漂洗液：取95乙醇(AR)45ml，冰乙酸(AR)5ml，和蒸馏水50ml，混匀置具塞试剂瓶中贮存。,五、测试材料,未溶血的人或动物血清,电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳压电源连接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通电，调整好电压，进行电泳。注意电泳槽的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前，该电泳仪已改进为数显式的DYY-6C型。 浸泡：将28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30 min方可用于点样。 点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。,操作指南：,六、操作步骤,1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，每组取醋酸纤维素薄膜1张，取时用镊子夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用它吸干表面液体。 2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。,3.点样： 点样时，先将毛细血管插入血清中，封住上端，在载玻片的一端均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把载玻片在薄膜毛面上轻而温和地印一下。点样区距阴极端1.5cm处（见图）。此步是实验的关键。,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）,4.电 泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度（24片薄膜则为14.4mA）。通电5min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度（24片薄膜则为24mA） ，电泳时间50min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。,5.染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min 6.漂洗： 将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。,7.记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。,8.整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。,七、注意事项,1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。,八、思考题,1. 根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在pH8.6的巴比妥-巴比妥纳电极缓冲液中移动的相对位置? 2. 简述醋酸纤维素薄膜电泳原理及优点。 3. 电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？,