实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌.ppt

实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实 验 目 的,学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 为下一步重组体筛选做准备,实 验 原 理,遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过程就是转化。 将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、 CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Competent cells)。,转化(Transformation) 是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0低温处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击（如42 ）下，细胞可吸收外源DNA。 为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。,Ampr：氨苄西林抗性基因 内酰胺酶,多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点,Amps菌株,Ampr,涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落- 转化子。,培养基上含有X-Gal和IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。,pET32a,pET32a,结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 复制起始位点 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等,pET-32a Vector,The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.,pET-32 cloning/expression region,Vector (pET-32a),Gene fragment (SmPR10),pET32a-SmPR10,材料、设备及试剂,材料 E. coli DH5菌株: R-、M-、Amp- (转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。） pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2 ng/l): 实验室自制 设备 恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。,试剂 1、LB固体和液体培养基 LB培养基配方：（单位g/L） 胰蛋白胨 10 酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂粉（1.5%） 15g （注：LB液体培养基不加琼脂粉） 按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100g/ml,摇匀后用培养皿铺板。,2、Amp母液： 称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22m滤器过滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20冰箱. 3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22m滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于4冰箱储存 . 4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制,操 作 步 骤,（一） 受体菌的培养 1、取-70或-20贮存的大肠杆菌DH5菌种，在LB培养液中培养过夜，进行活化; 2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。 3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）,（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将菌液转入1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于4、4000rpm离心10分钟。 2、弃去上清,用预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置10分钟后,4、4000rpm离心10分钟。 3、弃去上清,加入0.1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞。每份100l（注意悬液密度要均匀）,冰上放置备用。 4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80保存。,注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！,（三） 重组质粒DNA的转化 质粒和感受态细胞混和：在100l感受态细胞悬液中加入5l重组质粒DNA（ pET32a-SmPR10 ），轻轻混匀后冰上放置30分钟。 热击：42水浴中热击60秒（注：精确计算时间，热击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷2-5分钟。 复苏：向每管中加入800l LB液体培养基(注：不含Amp),混匀后在37150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。,思考：热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的pET32a，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但是为什么复苏时用的LB培养液不加Amp？,（四）涂布平板筛选转化质粒 将管中培养液摇匀后取100l 均匀涂布于含Amp的筛选平板上。 （注：将培养液摇匀后涂布。） 2. 正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37温箱中培养过夜，次日观察实验结果。,预期实验结果,感受态细胞+重组质粒,0.1MCaCl2+重组质粒,感受态细胞+无菌水,实验报告,思考题 (1). 根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？(2). 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？,实验中要考虑的重要因素,为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次继代或储于的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。10ng的cccDNA即可使100l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,