高通量测序技术在宏基因组学中的应用

高通量测序技术在宏基因组学中的应用196中国医药生物技术2019年6月第8卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2019, Vol. 8, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2019.03.008,综述.高通量测序技术在宏基因组学中的应用刘莉扬，崔鸿飞，田埂随着生命科学及研究技术的不断发展，人们对生命现象的了解更加深入。微生物因为 其在工业、农业、医疗卫生、环境保护等各方面的重要地位，被越来越多的研究者关注。 自然状态下，微生物几乎无处不在，无论是在自然环境如土壤、海洋甚至一些极端环境 (如酸矿水)中，还是在人类和动物的皮肤、口腔、肠道中，微生物都与它们所在的环境 相伴相生。除生存环境极为广泛以外，微生物的数量还极为庞大，以人类为例，人类的基 因总数只占人类身上微生物基因总数的1%左右1。这些微生物是环境能量、物质代谢的重要中间环节和组成部分，它们有些可以代谢 生成周围其他生物所必需的底物，而有些则会代谢生成毒性物质，导致环境污染，或者宿 主的疾病。因此，对微生物的研究显得极为重要。微生物的传统研究方法主要是依赖将微生物进行培养和分离(culture-dependent)。 然而，到目前为止，绝大多数微生物(99%以上)不能依靠这样的方式获得，这极大地限 制了人们对微生物的研究。随着测序技术和数据处理分析能力的飞速发展，以及人们对微 生物之间相互依存的共生互利和平衡关系的深入认识，一种可以对环境中所有微生物进行 研究而不依赖培养的新方向一一宏基因组学应运而生。1宏基因组简介宏基因组(Metagenome)，或称为“元基因组，于1998年由Handelsman等2 在一篇研究土壤微生物的文章中首次提出，当时的定义是“微生物群落中的所有基因组的 集合”。在此之后，宏基因组的概念渐渐为人们所接受，并涌现了许多针对海洋、土壤、 人类肠道等微生物的典型研究工作3-6，目前的宏基因组研究主要指对细菌的研究。宏基因组学研究与传统微生物研究方式的最大区别在于把微生物看成一个整体，摆脱 了对单个微生物培养和分离的步骤，直接对环境中所有的微生物进行研究，进而可以全面 地对所有微生物进行分析。随着宏基因组学研究技术的发展和研究者兴趣的不断增加，对 其研究手段和研究对象的重点也不断发生着变化，大致可以分为三个阶段：针对16S rRNA为主要研究对象的核糖体RNA研究；以环境中所有遗传物质为研究对象；以环 境中所有转录本为主要研究对象的宏转录组研究。狭义的宏基因组学研究指第二个阶段， 本文提到的“宏基因组学”倾向于广义的概念，即三个阶段的总和。原核生物的核糖体RNA,尤其是16S rRNA，由于其高度保守的序列特性，被当做可 以鉴别物种的微生物系统发育的“分子钟”7。第一代测序读长长、准确率较高，但通量较低，比较适合对16S rRNA进行测序及分析。随着高通量的第二代测序(next generation sequencing， NGS)方法的诞生，由于读长较短，所以从一次测序16S rRNA 基因全长，到只针对16S rRNA中的某一个或某几个高变区进行分析和研究8-11。宏基因组包含着环境微生物的全部遗传信息，相比于16S rRNA来说，宏基因组除了 群落中各种微生物的分类信息以外，更包含了所有微生物的基因信息。因此，这种数据更 有助于我们对群落潜在的功能进行深入分析。并且通过对基因组大小进行均一化 (normalization)，我们可以对群落中的微生物进行相对定量研究12。功能基因研究 则可以通过测序序列找到特定环境下富集的功能基因13。宏基因组是近年研究的热点， 数据量较为庞大，尤其需要高通量的测序技术和高效的数据处理能力作为依托。宏转录组数据则包含了环境微生物的全部转录本信息。与宏基因组中研究“可能的” 群落功能、代谢通路差异相比，宏转录组可以实时、实地的对微生物群落的基因表达情况 进行反映14。在新一代测序技术出现以前，利用传统测序技术发展出了使用EST序列 来发现新基因的方法，比较方便地得到了大量的基因序列的信息15。新一代测序技术的 出现，给宏转录组的研究带来了新的机遇，但是由于原核生物的mRNA较易分解、rRNA 含量极高，高质量的样本制备比较困难，因此现在的研究仍属于起步阶段16。2 测序技术的发展与高通量测序技术的特点世界第一台自动化测序仪诞生于1987年，由美国ABI公司制造，其原理基于 Sanger测序法17。Sanger测序因其较长的读长( 1000 bp)和较高的测序质量 (99.999%)，从20世纪90年代开始，就被广泛应用在生物信息学研究当中，并在人 类基因组计划(human genome program， HGP) 18中发挥了巨大的作用。但Sanger测 序法由于测序通量太低，速度较慢，渐渐不能满足日益增多的数据需求19。第二代高 通量测序则避免了 Sanger测序中所需的繁琐的克隆过程，大大减少了工作量，提高了 效率。随着测序技术的不断发展，单分子测序的技术，如HeliScope20、Picbio21 等测序技术逐渐开始发展。但由于技 基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划) (2019CB316504)作者单位：100084北京，清华大学自动化系清华信息科学与技术国家 实验室生物信息学研究部(刘莉扬、崔鸿飞)，生物医学测试中心(刘莉扬、田埂)通讯作者：刘莉扬，Email: llyjudy 收稿日期：2019-03-18中国医药生物技术2019年6月第8卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2019, Vol. 8, No. 3 197术并未十分成熟，测序正确率尚有待提高，而且成本较高，单分子测序技术尚未被广 泛使用。高通量测序技术是现今应用最广泛的测序技术，其特点是成本低、通量高、速度快， 可以快速产生大量的数据。高通量测序技术的读长普遍较短，目前三个应用较多的主流 平台中，Roche 454 GS FLX Tianium 能测 450 800 bp, Illumina HiSeq 2000 能测 150 bp （单向），其新推出的MiSeq平台最长可测至250 bp （单向），SOLiD 5500xl 能测75 bp （单向）。它们的测序深度可以在一定程度上弥补读长较短所带来的问题，深 入并且快速的测序过程也使它们得以成为现今应用最广泛的测序技术（表1）。进行测序分析。尽管不分析全长序列，由于高通量测序的覆盖深度非常高，对物种多 样性的分析仍十分有利。由于16S rRNA的分析目前已比较成熟，所以已有很多相关的研究，包括人体环境 （如皮肤、口腔、肠道、女性阴道等），自然环境（土壤、海洋等）的各类环境微生物群 落进行分析。2019年，美国科罗拉多大学的Fierer等25采集了 51个健康年轻人的 手部皮肤表面的微生物样本并利用Roche 454 GS FLX测序仪对其16S rRNA进行了测序， 研究了性别、用手习惯（即是否左撇子）、洗手习惯等对手表面细菌群落多样性的影响。 2019年，Lazarevic等8采集了 3个健康成年人的口腔微生物，对其V5区域进行扩 增并用Illumina进行测序，把V5区域当作分类标志，对人类口腔微生物群落的多样性 进行了分析。同年，Turnbaugh等9采集了 31对同卵双生和23对异卵双生的双胞胎 以及其母亲的粪便样本，进行肠道微生物研究，分析环境、肥胖情况等对人体肠道微生物 的影响。该研究除用Sanger测序法测了全长的16S rRNA序列以外，还用454 GS FLX 测序仪对16S rRNA的V2和V6区进行了深度测序，并以此为分类标志进行物种多样性 的分析。除人体微生物的研究以外，环境微生物也是一个大的研究方向。如2019年， Roesch等10利用454 GS FLX测序技术，对来自西半球的4个土壤样本中微生物16S rRNA的V9高变区进行了测序，并对其生物多样性进行了分析。值得一提的是，16S rRNA的应用也可与我国传统中医紧密联系起来。2019年，清 华大学的Jiang等11邀请了 19位患有慢性萎缩胃炎的志愿者，并通过传统的舌苔情 况，参照其症状进行判断，将志愿者分为寒症、热证，并与另外8位健康志愿者同时进 行舌苔样本的采集，用Illumina GAIIx测序平台对其微生物的V6高变区进行测序，分 析舌苔微生物群落与寒热症之间的关系，并认为舌苔微生物群落可以作为人体健康状态的 一个标志。高通量测序技术在基于16S rRNA的微生物群落分析中的要点在于产生测序覆盖深度 极深的16S rRNA的测序数据，并通过比对或聚类的分析方法，对数据来源的微生物物种 进行分析，并估计微生物群落的物种构成。相信随着高通量测序技术的发展，可测序列长 度会越来越长，更多研3高通量测序技术在宏基因组学研究中的应用3.1基于16S rRNA的微生物群落分析原核生物的16S rRNA基因，由于其具有鉴别物种信息的作用，被广泛地应用在了微 生物群落物种多样性的分析上16S rRNA的数据库资源较为丰富，如RDP22、 Greengene23、SILVA24等都是一些比较成熟、不断完善并被广泛使用的数据库，并有 一些自带的分类工具（比如RDP数据库的RDP classifer等）便于分析使用。在鉴定物种方面，两条16S rRNA基因的比对差异小于3%，则可以认为是同一个物 种（species）；差异小于5%，则可认为是同一个属（genus）；差异小于10%，则可认 为是同一个科（family）。通常研究者将环境微生物群落中的16S rRNA区域通过PCR 进行扩增和测序，并将测得的序列比对到已有的16S rRNA数据库中，通过数据库中的海 量数据，对每条16S rRNA的分类位置进行标定，从而得到微生物群落的物种构成、各个 物种的丰度等信息。此外，鉴于已知的16S rRNA数据库中信息有限，用比对已有数据库 的方法无法对未知的16S rRNA进行估计，因此还可以将16S rRNA序列聚类成分类操作 逻辑单元（operational taxonomic unit， OTU），利用OTU的数目、各个OTU的序列 数来分析估计物种多样性和丰度。此外，第一代测序由于测序长度较长，所以多采用全长 的16S rRNA测序进行分析。而第二代的高通量测序，由于其读长较短，无法覆盖全长， 因此许多研究都对16S rRNA的一个或几个高变区表1三大测序平台基本情况比较测序平台文库、样测序用化本制备Roche 454 GS FLX TianiumemPCR学试剂读长（bp）测序反应测序反应时间（d）焦磷酸测500 800序0.35产量（G） 0.8测序仪价格（$）500 000时间长、读长长，测序试剂贵、错 细菌基因组测序，基因组有利于提高重复序列的比对比例Illumina HiSeq 桥式 PCR 边合成边 2000 SOLiD 5500xlemPCR测序边连接边测序707 1450 1001004 10误率高、单碱基重复检出率低测序系统本数量存在瓶颈595 000双碱基纠正策略提测序时间过长高了准确度全基因组测序；宏基因组测序组装（优点缺点应用100 600540 000目前使用最广泛的同时可测序的样 全基因组测序；宏基因组198中国医药生物技术2019年6月第8卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2019, Vol. 8, No. 3究在分析16S rRNA时会选择进行全长分析，从而在微生物群落研究中得到精确的结 果。3.2基于宏基因组的功能基因分析对16S rRNA的测序可以快捷地对环境微生物的群落构成进行深入的分析，除了物种 多样性以外，希望得到更多的信息，比如基因信息等。在原核生物中，已知的物种只占极 少的一部分，对已知物种的功能、代谢等的研究相比于未知微生物依然是微不足道的。只 了解环境微生物的物种信息，远不能满足对于环境微生物群落与环境之间关系的探究，而 且原核生物的变异速度很快，即使是同一个种级别内部的两个菌株在功能上都可能有非常 大的区别7。因此研究环境微生物的全基因组就显得非常必要。在第一代测序的条件下，由于测序速度和成本的限制，对环境内所有微生物的全基因 组进行深度测序并不方便，而高通量测序则使之变成了可能。从环境微生物所有遗传信息 中，可以分析和预测出该环境微生物群落可能的功能，其与环境可能的相互作用关系。针对这种宏基因组的数据的分析，一般分为基于比对（alignment-based）的方法和 不基于比对（alignment-free）的方法。基于比对的方法把测序得到的所有读段比对到已 知的微生物核苷酸数据库上，如NCBI的NT数据库（利用Blastp等工具），或者是蛋 白质NR数据库（利用Blastx等工具），得到环境微生物在物种或功能基因上的丰度信 息，进而结合一些功能基因、代谢通路、信号通路等数据库，对研究者感兴趣的部分进行 分析。事实上，在基于比对的方法中，高通量测序所得的序列较短，而这种短序列直接进 行比对的效果往往不理想26，并且大量的原始数据进行比对会耗费很多时间，因此需要在比对前进行序列拼接，将其拼接成较长的序列，提高 分析效率和分析效果。此外，还可以用一些工具对序列进行基因预测（如 Metagene27、 GeneMark28、FragGeneScan29等）。基于比对处理高通量测序的宏基因组数据的应用非常多，2019年，华大基因在 Nature发表文章，对人体肠道微生物基因组研究计划（MetaHIT）进行了总结30。该研 究为研究人体肠道微生物群落与人类健康之间的关系，采集了 124个欧洲人的粪便样本， 其中包括25个炎症性肠病（inflammatory bowel disease， IBD）患者和99个健康志 愿者的样本，并用Illumina测序平台进行了测序，产生了 567.7 G的测序数据，并对 序列进行了拼接、注释、功能基因的分类、多态性分析等研究。2019年，华大基因在 Nature发表了一篇研究人体肠道微生物与II型糖尿病之间关系的文章31。该研究收 集了 345个中国人的肠道微生物样本，用Illumina测序平台对其进行了深度测序，并 在全基因组关联研究（genome wide association studies， GWAS）的基础上，开发了一 种叫做全宏基因组相关联研究（metagenome wide association studies， MGWAS）的方法， 对II型糖尿病与肠道微生物失调之间的关系进行了深入的研究。基于比对的方法准确性较高，由于已知的数据库有限，且比对花费的时间成本非常高。所以，在基于比对的方法之外，也产生了很多不基于 比对的方法和应用。不基于比对的方法大多根据序列特征，以连续k个碱基组成的短的 寡核苷酸序列（k字词、k-mer、k-tuple）作为特征，统计这些特征在序列中出现的频数， 并构建所有4k个k字词的频数（频率）向量。已有研究表明这种k字词在微生物基因 组中的出现频率可以分辨微生物的不同物种32。基于k字词的方法大多数被应用在快 速对测序序列进行物种分类的方面（binning），这种方法的基本思想是将序列的k字词 出现频数（频率）向量与数据库中的微生物各个物种的k字词向量作比较，将相近的划 归为一组，如AbundanceBin33、MetaCluster34等都是基于这种方法进行序列的物种 划分的工具。此外k字词的方法也可以应用于分析样本之间的差异。如Willner等35 于2019年发表文章，对86个宏基因组样本，分别用长度k = 2、3、4的k字词进行 了统计，为每个宏基因组样本构建一个k字词的频数（频率）向量，并对86个样本的 向量进行主成分分析、层次聚类等分析和观察。不基于比对的方法避开了复杂的计算量， 在对于宏基因组的这种以未知物种为主的分析，k字词分析的优势非常明显，将成为宏基 因组的一个重要的研究方向。高通量测序在宏基因组分析中的应用，由于分析方法的多样性，要点也不一而同。但 总的来说，基于比对的方法一般需要进行序列拼接、基因预测、基因比对进而对群落的基 因功能进行分析，而不基于比对的方法一般直接对序列特征进行统计。3.3基于宏转录组的群落转录调控规律分析宏基因组可以详细地展示环境微生物群落中的所有遗传信息。为了精确地了解环境中 正在发生的代谢过程，宏转录组的概念越来越多地被研究者们重视起来。相较于单纯的微 生物基因组信息，宏转录组记录了特定时间、特定地点的微生物群落的表达谱。在活的微 生物中，在某个特定时间，也并非全部基因都参与表达，而是随着环境、生长周期的变化， 一部分基因有选择地被激活，进行表达。宏转录组学可以实时地记录这些活跃的基因及它 们的表达量。在宏基因组中，一些已经死亡却尚未被分解的微生物的遗传信息依然可以被 检测到，这些微生物本身已经不主动参与到环境的代谢当中，但是由于它们被检测到，从 而对研究的结果产生一定影响。宏转录组学的主要方法是对环境微生物样本中的mRNA进行提取和扩增，反转录成为 cDNA并进行测序。宏转录组的实验难度较大，一方面是由于原核生物的转录和翻译同时 进行，mRNA几乎没有修饰，容易被降解，半衰期极短（约为分钟量级），因此制备高质 量的样品库是实验成功的关键。另一方面，由于原核生物的rRNA占全部RNA的比例非 常大（约70% 90%） 16, 36-37，因此在制备样品时通常需要去掉rRNA，以降低测序 成本，有效地去除样本中的rRNA也成为了一个重要课题。宏转录组学从2019年开始，已经有很多的相关研究，中国医药生物技术2019年6月第8卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2019,Vol. 8, No. 3 199几乎所有的研究都是由高通量测序提供的数据。如2019年，Poroyko等38用 454GSFLX测序平台对两组小猪(一组为母乳喂养，另一组为配方奶喂养)的肠道微生物进 行了转录组测序；2019年，Xiong等39对非肥胖者糖尿病(non-obese diabetic，NOD) 的老鼠进行研究，设计了 8种微生物植入无菌老鼠的肠道，培养后以不同试剂盒制备样 品，并用Illumina平台进行转录组测序。随着实验技术的发展，已经有越来越多的宏转 录组数据相继发表出来。高通量测序在宏转录组中的应用，要点与在宏基因组分析中的应用类似。但由于技术 尚在摸索之中，现阶段的难点依然在于测序前样品的制备和保存。3.4单细胞分离及宏 基因组研究由于宏基因组研究在组装微生物基因组和研究相似基因序列功能上的局限，当研究深 入到一定的水平以后，研究者又对群体中每一个细菌的作用和不同细菌的相互关联产生兴 趣。以单细胞分离、扩增为主要方法的单细胞测序方法应运而生40-42。单细胞宏基因组，是指将环境里所有微生物进行单个细胞的分离，而后通过全基因组 扩增，或者提取RNA反转录后进行扩增，来研究群体里单个细胞的基因组和转录组，进 而得到整个群体更加完整的信息。单细胞的研究，在很多方面具有较大的优势，但在技术 上还是遇到了一些问题。微生物群落巨大，分离单细胞本身就是一个非常有挑战性的工作， 目前主要应用的方法，是利用流式细胞仪，将细胞通过各种染色方法进行染色，通过各种 染色特性来进行区分，而细胞的染色特征可能因为不同的状态而存在差异，因此存在分离 不纯的问题42；在扩增技术上目前还没有实现突破，有扩增带来的偏向性(bias)，组 装基因组形成了一定的困难41；随着单分子测序技术的不断发展，未来单分子和单细胞 的结合，必将会为宏基因组研究带来新的突破。4结语高通量测序技术通量高、速度快，适合宏基因组的深度测序研究。已经有相当多的宏 基因组研究工作建立在高通量测序技术上，揭示微生物与环境之间的关系。同时，高通量 测序读长短、数据量大的特点，对于宏基因组数据的处理也是一个挑战，催生出许多宏基 因组特有的算法和工具。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究带来更多的机会。 未来的高通量测序技术，除了进一步发展其通量高的优势以外，读长也会逐渐增加，同时 测序错误率也会更低，现阶段研究中遇到的问题将逐步得到解决和改善。此外，目标为单 分子测序的第三代测序技术的发展，也会带来全新的数据特点，宏基因组学研究将有更多 的机会和发展空间。参考文献1Ley RE, Peterson DA, Gordon JI. 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