响应面法优化香菇多糖发酵培养基ppt课件

呼应面分析法优化香菇多糖发酵培育基主要内容n1.香菇多糖与提取方法简介n2.Plackett-Burman设计法与呼应面分析法n3.实验资料与方法n4.Plackett-Burman优化培育基实验设计n5.呼应面法优化培育基组成n6.结论1.香菇多糖与提取方法简介n香菇多糖：是一种生理活性物质。它具有抗病毒、抗肿瘤、调理免疫功能和刺激干扰素构成等功能。n提取方法：从香菇子实体或经深层发酵后的发酵液中提取。香菇子实体生长周期长，产量和多糖得率均较低。而深层发酵培育香菇菌丝体不仅发酵液中含有与子实体相当或更高的营养物质，同时还可利用农副产品作原料，本钱低，周期短，易于大规模消费，因此已得到广泛运用于注重。n 但目前香菇菌丝体发酵程度较低，经过优化条件以提高多糖含量是发酵过程中急需处理的问题。2.Plackett-Burman设计法与呼应面分析法n同：n 都是20世纪中叶后开展起来的的优化实验条件的统计学方法。能用较少的实验次数推算出目的值的优化条件，优化效率高。n异：n Plackett-Burman实验就是挑选实验设计，主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于相应变量的显著性，采用的实验方法。n 呼应面分析法是一种优化实验条件寻优的方法，它经过实验设计、建模、检验模型的适宜性，寻求最正确组合条件的众多实验和统计技术。n 本实验优化香菇多糖培育基方法用Plackett-Burman实验设计挑选影响香菇产多糖的主要要素用Box-Behnken实验设计对培育基做呼应面分析实验回归模型验证明验，确定最优培育基最陡爬坡法确定要素程度用统计软件SAS8.0进展回归拟合，建立回归模型与方程3.实验资料与方法n3.1菌种来源：香菇，本实验室分别保管浙江庆元n3.2试剂：马铃薯购自农贸市场，鱼粉为浙江工业大学药学院提供，其他所需的主要试剂均为分析纯，n3.3培育基与培育方法n 斜面培育基：采用PDA 培育基。种子培育基组成为%：葡萄糖2，蛋白胨0.25，酵母膏0.25，初始pH 自然，121灭菌30min。初始发酵培育基成分为%：葡萄糖1.5，酵母膏0.5，MgSO47H2O0.1。初始pH 5.5，121灭菌30min。n 斜面菌种转接至装有100mL 种子培育基的250mL 三角瓶中，置回转式摇床180r/min，25培育5d。然后将菌丝体无菌条件下打散制成种子悬液，以10%的接种量转接入100mL/250mL的发酵培育基中，回转式摇床180r/min，25培育6d 后终了。n3.4粗多糖提取n 将发酵菌悬液离心4,000r/min，20min，分别搜集上清液和菌体。上清液中参与无水乙醇至75%v/v，冰箱保管过夜，再经离心8,000r/min，10min，取沉淀用于胞外多糖测定。菌体洗涤后，悬浮于一定体积的去离子水中，超声波破壁300Hz，10min)，高速离心10,000r/min，10min搜集上清液，处置过程同上，用于胞内多糖测定。粗多糖为胞内多糖与胞外多糖之和。n1.5 粗多糖测定n 粗多糖含量测定采用苯酚-硫酸法Dubois et al.19564.Plackett-Burman优化培育基实验设计n4.1 Plackett-Burman4.1 Plackett-Burman实验挑选主要影响因子实验挑选主要影响因子n 本实验选用本实验选用N=12N=12的的Plackett-BurmanPlackett-Burman实验设计，对实验设计，对葡萄糖葡萄糖A A、鱼粉、鱼粉B B、VB1VB1C C、NaClNaClD D、FeSO4FeSO4E E、MgSO4MgSO4F F、KH2PO4KH2PO4G G和初始和初始pHpHH H8 8个要素进展调查，每个要素取高个要素进展调查，每个要素取高+低低-两个两个程度，高程度约为低程度的程度，高程度约为低程度的1.251.25倍，呼应值为总粗多倍，呼应值为总粗多糖产量糖产量Y Y，实验设计见表，实验设计见表1 1，要素程度取值、效应，要素程度取值、效应及显著性分析见表及显著性分析见表2 2。表1 Plackett-Burman 实验设计与结果BACK表2 Plackett-Burman 实验分析结果由表可知，在香菇菌株产多糖过程中葡萄糖、鱼粉和KH2PO4这3个要素对多糖产量显著，可思索作为主要要素进一步做呼应面实验。4.2 最陡爬坡实验设计及结果最陡爬坡实验设计及结果n要得到呼应面拟合方程，必需求先逼近最正确值区域。而本方法以实验值的变化方向为爬坡方向，根据各要素效应值大小确定变化步长。根据表2分析结果，确定不显著要素的程度，表现为负效应的要素取低值程度，正效应的取高值。显著要素的变化步长及方向的实验设计及结果阐明表3，第3组产量最高，因此以第3组的程度作为呼应面实验的中心点，即葡萄糖2%，鱼粉1.0%，KH2PO40.1%。0.50.051.5最正确组5.呼应面法优化培育基组成n5.1Box-Benhnken实验设计与分析：n 根据Plackett-Burman实验和最陡爬坡法实验确定的要素与程度。采用Box-Benhnken实验设计对产多糖发酵培育基进展3要素3程度的呼应面分析实验。呼应面实验中心点表5 Box-Behnken 实验设计及相应结果3个中心实验效果佳5.2二次回归模型拟合和方差分析n利用系统软件SAS8.0对表5实验数据进展二次多项回归拟合，经过RESEG呼应面回归过程进展数据分析，建立二次呼应面回归模型，并寻求最优相应因子程度，得到回归方程：nY=2.667+0.44625X1+0.045X2-0.05X3-0.44583X12-0.33X22-0.09083X32-0.1175X1X2+0.015X1X3-0.0725X2X3模型的F检验值在=0.05时远大于F9,5=4.77，阐明方程有很高的显著性。R2=0.9973，阐明方程模型与实验数据有99.73%的符合度，调整后的R2adj=0.9925，阐明方程模型有很高的可信度。葡萄糖影响最为显著多糖开场由X2X3浓度添加而减少两者相互作用显著5.3培育基最适组合n在获得非线性回归模型和呼应面之后，为了求得培育基最正确浓度，对所得的回归拟和方程分别对各自的变量求一阶偏导数，并令其为得到三元一次方程组，求解此方程组可以得到最大多糖量时的最正确条件：nX1=0.5066(2.2533%)，X2=-0.0488(0.9756%)，X3=0.0144(0.0993%)，Y=2.2487g/L。所以产多糖最高时的培育基组成为：葡萄糖2.2533%，鱼粉0.9756%，VB1 0.003%，NaCl0.8%，MgSO47H2O 0.1%，FeSO47H2O 0.04%，KH2PO4 0.0993%，初始pH值5.5。回归模型验证明验n根据最优培育基配方对模型进展验证，香菇菌丝体产粗多糖为2.33g/L，实践值与预测值的误差为+3.61%。初始培育基条件下总多糖产量为0.80g/L，优化后提高了1.91倍。该结果阐明，呼应面法优化产香菇粗多糖最正确培育基是可行有效的。6.结论n 该研讨经呼应面方法优化，得出菌株产多糖的最正确培育基配方为：n 葡萄糖2.2533%，鱼粉0.9756%，VB1 0.003%，NaCl 0.8%，MgSO47H2O 0.1%，FeSO47H2O 0.04%，KH2PO4 0.0993%，初始pH值5.5。在优化条件下经3批摇瓶培育实验验证，粗多糖产量均值为2.33g/L与预测值2.2487g/L误差为+3.61%，与原始培育条件相比，多糖产量提高了1.91倍。n 实验证明呼应面方法对培育基优化是非常有效的工具，Plackett-Burman实验设计能对影响多糖产量的各要素效应进展评价并能有效地找出主要要素，最陡爬坡法能充分接近最大呼应面区域，Box-Behnken实验设计能建立主要要素影响多糖产量的二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进展了显著性检验，优化了内在要素程度，找出最正确值。